Palavras-Chave
Aminoglicosídeos, Ototoxicidade, Vestíbulotoxicidade, Doença de Ménière

Resumo
Os AGAs são drogas bactericidas potentes com amplo espectro de ação e comportamento farmacocinético bem como pode induzir importantes efeitos colaterais como a nefrotoxicidade e a ototoxicidade. A Ototoxicidade ocorre tanto no nível coclear como vestibular, mas alguns AGAs como a neomicina são predominantemente cocleotóxicos e outros como a estreptomicina e gentamicina, predominantemente vestibulotóxicos. Na DM existem danos cocleares e vestibulares com crises de vertigem, perda auditiva progressiva e flutuante, zumbidos e desequilíbrio. A vertigem pode ser tratada através da labirintectomia da orelha afetada utilizando-se de AGAs predominantemente vestibulotóxicos. O presente estudo tem como objetivo a obtenção de novos AGAs com ototoxicidade e vestíbulotoxicidade seletivas e dissociadas. Para isto utilizamos a neomicina e obtivemos, entre outras, 02 frações moleculares, a neamina e a N-metil neobiosomidina-B(NMB). As frações foram testadas por ensaios para verificar sua ação coclear e vestibular através de medidas do Potencial evocado auditivo de tranco cerebral(PEATC), emissões otoacústicas por produtos de distorção(OEA-PD) e microscopia eletrônica de varredura(MEV). Somente a NMB mostrou-se vestibulotoxica seletiva, sem causar dano às células ciliadas externas ou internas, comprovado por MEV, PEATC e OEA-PD, nos animais estudados. A NMB parece ser o primeiro composto com características vestibulotóxicas seletivas que poderia ser utilizada em ensaios clínicos para o tratamento da DM.

Keywords
Aminoglycoside; cochleotoxic; vestibulotoxic; Ménière's Disease

Abstract
The AGAs, are nearly all potent bactericidal agents that share general range of antibacterial activity, pharmacokinetic behavioral and important side-effects, represented by impairments of renal and inner ear functions. The ototoxicity includes the concomitant damage of cochlear and vestibular hair cells. However, there are AGAs mainly cochleotoxic(CT) such as neomycin, and fundamentally vestibulotoxic(VT) such as streptomycin and gentamicin. In the MD, there is a cochlear and vestibular damage which unable episodes of vertigo, progressive deafness and humming. The vertigo may disappear by chemical labirintectomy in the sick ear using mainly AGAs VT, Frequently however an undesirable hearing loss side-effect can occur by the use of non-specific AGAs VT. Therefore the present study concerns the obtention of new AGAs with selective CT-dissociated VT. For this, from the most potent ototoxic AGA, neomycin, we obtained the two molecular fractions: neamine(N), methyl-neobiosamine-B(NMB). The all fractions were evaluated in cochlear and vestibular assays: (1) the brainstem evoked auditory potential(BEAP), (2) distortion product otoacoustic emissions(DPOAE) and (3) scanning electron microscopy(SEM). Only (NMB) showed to be selective VT agent, without damage of inner and outer hair cells comproved by SEM, DPOAE and BEAP in all animals studied. This is the first compound with this characteristic to be able to use in clinical trials for the treatment to MD.

Os antibióticos aminoglicosídeos (AGAS) possuem anéis aminociclitóis (derivados de poli-hidroxiciclo-hexano) unidos a aminoaçúcares por ligações glicosídicas.  São altamente potentes no tratamento de infecções causadas por bacilos gram-negativos, como espécies de Pseudomonas, enterobacterias, cocobacilos e o Micobacterium tuberculosis ¹.

Dentre os aminoglicosídeos pode-se citar a estreptomicina, neomicina, gentamicina, canamicina, etc, isolados de microrganismos da ordem dos Actinomicetaes ^{2, 3}.

Estes antibióticos apresentam efeitos colaterais agudos, subagudos e crônicos, como a nefrotoxicidade e ototoxicidade (coclear e vestibular), sendo este o principal inconveniente em seu uso crônico. No entanto, os antibióticos com vestibulotoxicidade seletiva são estudados com importante aplicação no tratamento da Doença de Meniére (DM), com o objetivo de ablação química das células sensoriais do labirinto posterior, com destruição do mesmo, resultando em cessação dos sintomas de vertigem que são os mais importantes nesta doença ^{4, 5}.

AGAS como a gentamicina, por exemplo, têm sido utilizados desde a década de 1950 para a ablação química vestibular nos casos de vertigem intratável associada à doença de Ménière. O inconveniente é que a gentamicina, assim como a streptomicina causa lesão também ao labirinto anterior, representado pela cóclea, com destruição irreversível de suas células ciliadas externas traduzindo-se em perda de audição principalmente para freqüências de sons agudos ^{4, 6, 7, 8, 9, 10}.

A gentamicina que hoje é comercializada é composta por três maiores componentes, que são o GM-C1, GM-C2 e GM-C1a e que perfazem 90% a 100% da composição química da droga ¹¹.

Estudos realizando a purificação e separação dos três compostos da gentamicina mostraram que o componente C2 é mais cócleotóxico que vestibulotóxico, enquanto que o componente C1a é o mais vestibulotóxico ^{11, 12, 13} .

Assim, propomos a fragmentação química do sulfato de neomicina B ^{14, 15} que será realizada para explorar a correlação entre a estrutura química dos seus derivados, por modificação molecular dos grupamentos amino de neamina, com sua atividade quanto a cócleotoxicidade ou vestibulotoxicidade seletivas, que permita sua utilização futura em tratamento de doenças labirínticas como a Doença de Mèniére.

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção química dos derivados:

Os derivados obtidos foram sintetizados a partir do sulfato de neomicina comercial (GIBCO^TM). Os produtos obtidos foram analizados por espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear RNM 1H a 400 MHz em aparelho Bruker Advance DPX 400 e por espectrometria de infravermelho (IV) no espectrômetro IVFT - Nicolet Meodelo Protege 460, em cela de KBr. As análises de cromatografia delgada (CCD) foram realizadas utilizando placas de sílica gel 60 GF 254 da MERKÒ ^{14, 15, 16, 17, 18} .

A neamina na forma de base livre foi obtida pelo método de Leach e Teeters. ^{16, 17}. A obtenção da metil-neobiosamidina foi obtida pela reação de metanólise ácida do sulfato de neomicina tratada com éter etílico anidro, purificada em CCD e analisada por RNM 1H para verificação da pureza e identificação ^{17, 18 19, 20, 21, 22} .

Testes Biológicos de Ototoxicidade e Vestibulotoxicidade:

O estudo foi aprovado no Comitê de ética em pesquisa animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

Os animais foram selecionados do biotério central da Universidade de São Paulo - Campus Ribeirão Preto, através da pesquisa do reflexo de Preyer. Escolhemos animais com peso variando entre 400 gramas e 600 gramas, pela facilidade de manipulação do meato acústico externo para a realização dos exames audiológicos de emissões otoacústicas e Potenciais Auditivos evocados de Tronco encefálico, bem como por facilitar a inoculação da droga via intratimpânica.

Após um repouso auditivo de 24 horas, os animais eram reavaliados e desta vez, realizávamos a otoscopia manual. Os animais que apresentaram sinais de otite externa ou média aguda foram descartados para o experimento. Os animais que apresentaram rolha de cerume, de fácil remoção foram incluídos no experimento e os que apresentaram cerume de difícil remoção ou alterações inflamatórias do conduto auditivo externo, ou mesmo conduto auditivo muito estreito para acomodar adequadamente a sonda do equipamento de emissões otoacústicas, foram descartados.

As cobaias foram então submetidas a uma triagem auditiva por emissões otoacústicas por produto de distorção (OEAPD) e avaliação eletrofisiológica auditiva através dos potenciais evocados auditivos de tronco encefálico (PEATE) em cabine com isolamento acústico e sob anestesia com cloridrato de cetamina (65 mg/Kg) e xylazina (6,5 mg/Kg). As que apresentaram emissões otoacústicas por produto de distorção presentes nas duas orelhas e PEATC mostrando onda I presente com 5 dB de estímulo foram consideradas para o experimento ^{23, 24, 25} .

A inoculação intratimpânica era realizada imediatamente a realização dos exames audiológicos através de visão otomicroscópica. A droga era inoculada por seringa descartável graduada de 0.1 ml e AGULHA 30 g ½. O Controle do volume inoculado dependeu do refluxo da droga pelo orifício da inoculação e variou de 0,3 a 0,6 ml. Após inoculação os animais permaneceram 3 horas com a cabeça inclinada 45° em decúbito dorsal, para minimizar o deslocamento da droga da fenda auditiva pela tuba auditiva ²⁶.

Os exames de OEAPD e PEATC foram realizados no 11º dia pós inoculação e em seguida os animais foram sacrificados para a realização do estudo de microscopia eletrônica de superfície.

Para a avaliação funcional das células ciliadas externas cocleares utilizamos as Emissões Otoacústicas  por Produto de Distorção (EQUIPAMENTO: ILO 92 CAE System Otodynamics LTD).

O teste de emissões otoacústicas por produtos de distorção foi realizado pré-tratamento e momentos antes dos animais serem sacrificados, seguindo a relação de freqüências  2F1 - F2 com relação F1:F2 = 1,22, resolução 2 pontos por oitava ^{23, 24}.

Consideramos as emissões otoacústicas a partir de 1,5 kHz, pois as dimensões do conduto auditivo externo da cobaia fazem com que haja uma dificuldade de detecção das emissões otoacústicas abaixo desta freqüência, obtendo respostas que coincidem com as respostas do ruído^{23, 24}.

Desta forma, ao analisarmos a freqüência de 2 kHz, oferecemos um tom puro um pouco acima e um pouco abaixo, de tal modo que a relação entre eles seja de 1,22, obtendo assim, automaticamente, uma resposta de freqüência resultante seguindo a relação 2F1-F2 (abaixo da freqüência avaliada) e 2F2-F1 (acima da freqüência resultante). Deve-se ainda levar em consideração que as intensidades de f2 e f1 podem ser iguais ou diferentes. Neste estudo utilizamos intensidades iguais de 70 dB NPS. A intensidade do estímulo desencadeante pode variar numa faixa de 0 a 70 dB NPS e podem ser medidas na faixa de 500 a 8000 Hz^{23, 24}.

As otoemissões resultantes costumam ser em torno de 55 dB NPS menos intensas que o estímulo provocante. Neste caso, um estímulo de 70 dB NPS, provavelmente teríamos uma emissão otoacústica produto de distorsão de mais ou menos 10 ou 15 NPS, o que varia de indivíduo para indivíduo^{23, 24}.

Deste modo foi observado o chamado "DPGRAM", o audiocócleograma, onde tem-se um estímulo que é o som e uma resposta que também é um som e que fornece a função das células ciliadas externas cocleares responsáveis pelas freqüências analisadas^{23, 24}.

Neste estudo consideramos como mais importante as emissões otoacústicas nas freqüências mais agudas que  avaliam o estado funcional das células ciliadas externas na espira basal da cóclea, no entanto, a avaliação é qualitativa. Foram consideradas as emissões otoacústicas por produtos de distorção como presentes e ausentes^{23, 24}.

Para a avaliação do PEATE utilizamos o programa Compass Meridiam 2000 - Nicolet, LTD. Os seguintes parâmetros foram utilizados:

Estímulo em Tone Busrst, 4.000 Hz, intensidades de 60, 40, 20 , 10 e 5 dB, com fone de inserção auricular ²⁵.

Taxa de estímulo: 11 / seg.

Amplificação; 5 mV / 200 nV.

Filtros passa alta e passa baixa: 150 e 3000 Hz.

Para a avaliação anatômica de lesão celular às células ciliadas externas, utilizamos a Microscopia Eletrônica de Varredura.

As cobaias foram sacrificadas em tempo programado após administração das drogas via intraperitoneal e então sacrificadas após anestesia com éter, tendo sido decapitadas e suas cócleas removidas da bula.

Com dissecção microscópica as cócleas foram perfundidas com solução de fixação com glutaraldeído 3 % a 4 ^o Celsius e mantidas na solução por 24 horas para a fixação. Os passos seguintes foram realizados no Laboratório de Microscopia Eletrônica do Departamento de Morfologia da FMRP-USP.

Através da janela redonda foi injetado para fixação uma solução de glutaraldeído a 3% em tampão fosfato 0,1 M, pH = 7,4, por 4 horas a 4 ^o Celsius, lavadas  03 vezes por 5 minutos com o mesmo tampão, após foram fixadas com tetróxido de Ósmio  1% por 2 horas  a 4 ^o Celsius e submetidos a uma desidratação à temperatura ambiente em uma bateria crescente de etanol (50%, 70%, 90% e 95% - uma vez por 10 minutos  em cada concentração) e etanol absoluto 3 vezes por 15 minutos. Terminada a desidratação, seguiu-se para a secagem pelo método do ponto crítico em CO₂, onde o material ficou desprovido de água. Após ser fixado em porta espécime adequado, o material foi revestido em câmara de vácuo com vapores de ouro e examinados em microscópio eletrônico de varredura ^{25, 26}.

Foi utilizado o Microscópio Eletrônico JEOL SCANNING MICROSCOPE - JSM 5200.

Drogas utilizadas, doses e via de administração:

As amostras foram preparadas na concentração de 0,22 N., escolhida empiricamente, considerando-se o que estudos da literatura relatam para a para a aplicação da gentamicina intratimpânica em humanos. A concentração em normalidade visa padronizar o número de moléculas aplicadas no teste de forma a melhor comparar os resultados obtidos. Para que as amostras estejam livres de contaminação, após dissolvidas são filtradas em filtro MILLEX - GS MILIPOREÒ de porosidade de 0,22 mm, acomodadas em eppendorf esterilizados em mufla a temperatura de 200 ° C por um período de 2 horas.

1.      Neomicina: concentração de 267 mg/ ml - via intratimpânica na orelha direita. Neamina: concentração de 72 mg/ ml - via intratimpânica;

2.      N-metil-neobiosamidina: concentração de 88 mg/ ml - via intratimpânica;

3.      Xilazina (2g/100ml) - 6,5mg/Kg via  intraperitoneal;

4.      Cloridrato de Cetamina (50 mg/ml) - 65mg/Kg - via intraperitoneal;

A orelha esquerda de cada animal foi considerada seu próprio controle, com a injeção intratimpânica de água para injeção (EquiplexÒ) cujo volume variou de 0,3 a 0,6 ml/orelha até seu refluxo pelo orifício de inoculação.

GRUPOS DE ESTUDO:

Grupo 1: 6 animais - neomicina 267 mg/ ml ( via intratimpânica - orelha direita), aplicação única.

Grupo 2: 6 animais - neamina 72mg/ ml (via intratimpânica - orelha direita), aplicação única.

Grupo 3: 6 animais - N-metil-neobiosamidina 88 mg/ ml (via intratimpânica - orelha direita), aplicação única.

RESULTADOS:

Da fragmentação química os seguintes compostos foram obtidos conforme o esquema abaixo:

Esquema 1: Fragmentação química do sulfato de neomicina, resultando em neamina e N-metil-neobiosamidina.

Quanto aos estudos de Oto e vestíbulotoxicidade a N-metil-neobiosamidina mostrou toxicidade seletiva vestibular em todas as 06 orelhas analisadas, mostrando um padrão de normalidade quanto a análise sobre microscopia eletrônica de superfície, com presença de células ciliadas externas e internas normais e destruição das células ciliadas vestibulares tanto nas máculas sacular e utricular quanto nas ampolas dos canais semicirculares (Figura 1).

Os exames de EOA - PD mostraram - se presentes e o PEATC mostrou - se limiares de 5 Db, sem alterações morfológicas das células ciliadas externas e internas, em todas as 06 orelhas analisadas. (Figura 2 A,B,C).

A neomicina mostrou dano ás células ciliadas externas da cóclea em todas as 06 orelhas testadas, com preservação das células ciliadas internas e lesão vestibular em 3 das orelhas testadas (Figura 3). A neamina acarretou lesão coclear, mas não acarretou lesão vestibular (figura 4). Os dados referentes aos achados nos 03 grupos estão descritos na tabela 1.

DISCUSSÃO:

Os AGAs foram os primeiros antibióticos antituberculosos estudados e utilizados, sendo considerados atualmente no tratamento da tuberculose que tem sua incidência crescente, principalmente com o advento da AIDS ^{1, 2}.

A doença de Méniêre é uma patologia da orelha interna que se caracteriza por crises paroxísticas de vertigem típica, hipoacusia neurossensorial flutuante, zumbidos e sensações de pressão na orelha. É de prevalência elevada e sua incidência, apesar de sofrer influências raciais, genéticas e ambientais, está longe de ser pequena ⁵.

O problema básico do Méniêre, seja ele de causa conhecida ou não, reside na má absorção da endolinfa ao nível do ducto e/ou saco endolinfático. A medida em que a produção de endolinfa se mantém constante e a sua reabsorção esteja diminuída ou abolida, ocorrerá um acúmulo desse líquido no interior do sistema endolinfático (hidropsia) com elevação da pressão hidrostática e, finalmente, hipertensão do sistema acrescida de todas as suas conseqüências ^{5, 7, 8, 9, 10}.

Em aproximadamente um quarto dos pacientes com Méniêre é possível identificar uma causa. Até 20% dos pacientes apresentam história familiar positiva para essa doença, sugerindo que aspectos genéticos podem estar envolvidos em alguns casos. Várias patologias tais como sífilis, otite média, meningite, trauma, otosderose e doença auto-imune podem levar ao quadro semelhante à Doença de Ménière, cursando com hipertensão endolinfática ^5,7.

Tem sido demonstrado que o sáculo excessivamente dilatado pode estender-se em direção ao interior de um dos canais semicirculares e mecanicamente comprometer a crista ampular, causando assim vertigem instantaneamente. Em relação aos sintomas cocleares, parece que a hidropsia poderia interferir com a progressão das "ondas viajantes. Endococleares ^{5, 7, 8, 9}.

A tríade sintomática da doença de Ménière é composta por sintomas vestibulares, auditivos e pressão aural. Normalmente esses sintomas aparecem em conjunto; entretanto, muitos pacientes desenvolvem isoladamente os sintomas vestibulares ou auditivos em um primeiro momento por meses ou anos até o quadro se tomar completo. A vertigem paroxística é o sintoma mais incapacitante dessa doença, estando presente em 96,2% dos casos ^{5, 7, 8, 9, 10}.

A doença de Ménière atípica é caracterizada pela presença sintomática auditiva ou vestibular, isoladamente, sendo que a Coclear é caracterizada pela surdez neurossensorial flutuante e progressiva. Está última está associada à pressão aural enquanto que a Vestibular apresenta vertigem paroxística, não estando aliada à perda auditiva ^{5, 7, 8}.

Não existe tratamento eficaz da doença de Ménière até o momento e os tratamentos clínicos ou cirúrgicos disponíveis não são completamente efetivos ou promovem riscos para os pacientes. Devido a estes inconvenientes, o uso de antibiótico aminoglicosídeo vestibulotóxico (estreptomicina e gentamicina) tem sido proposto para provocar uma labirintectomia química na orelha doente sendo indicada principalmente para os pacientes com doença bilateral incapacitante ou em doença incapacitante acometendo ouvido único. Com a lesão química do epitélio vestibular os principais sintomas incapacitantes como a vertigem são quase totalmente abolidos: O uso desta técnica é mais segura do que cirurgias intracranianas, no entanto, existem limitações porque os antibióticos aminoglicosídeos utilizados são também lesivos a cóclea, provocando surdez variável e irreversível, devido à dupla ação do antibiótico na cóclea e no sistema vestibular ^{5, 7, 8, 9, 10}.

Vários autores têm relatado índices bastante elevados no controle da vertigem usando o método de injeção intratimpânica de estreptomicina, ao mesmo tempo em que preservam a audição em níveis aceitáveis, mas diferentes estudos deixam clara a sua insatisfação com essa terapêutica ^{7, 8, 9, 10}.

O estudo da relação estrutura-atividade dos resíduos de fragmentação dos antibióticos aminoglicosídeos pode originar produtos simplificados, com atividade vestibular seletiva e dissociada da atividade coclear e que podem mostrar-se mais seguros e efetivos para o tratamento da Doença de Ménière, como pudemos observar nos estudos de modificação testes de estrutura e atividade para o composto N-metil-neobiosamidina.

O uso de neamina como protótipo, contendo unidades I e II (esquema 1), representa urna tentativa de eliminação da atividade cocleotóxica, uma vez que a unidade 3-aminoglicose (III) foi reconhecidamente tóxica por Owada. Como descrito na literatura a unidade 3-aminoglicosídica não é fundamental para atividade biológica, sendo alvo de inúmeras enzimas inativantes no processo de desenvolvimento de resistência aos antibióticos aminoglicosídicos ¹¹.

CONCLUSÃO

O composto N-metil-neobiosamidina mostrou-se efetivo quanto a sua atuação vestibulotóxica seletiva, sem causar danos cocleares quando estudado em MEV, OEA-PD e PEATC, sendo o primeiro composto derivado de AGAs com esta características o permitiria sua utilização em ensaios clínicos para o tratamento da Doença de Ménière.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

01)      CHAMBERS, H. F. and SANDE M. A.; Fármacos antimicrobianos (CONTINUAÇÃO): OS Aminoglicosídeos. In: GOODMAN & GILMAN, (eds.) As Bases Farmacológicas da Terapêutica, 9.ed, Rio de Janeiro - RJ, McGrawHill, 1996, capo 46, p. 812-825.

02)      MITSCHER, L. A.; Antibiotics and antimicrobial agents. In:FOYE, W.O. e1. all. (eds.) Principies Of Medicinal Chemistry, 5.ed, Baltimore. Willians & Wilkins, r 2002, capo 34, p. 788-791.

03)      TRABULSI, L. R., SOARES, L. A; Antibióticos Aminoglicosídeos. In: Penildon r Silva (eds.) Farmacologia, 6. ed, Rio de Janeiro - RJ, Guanabara Koogan, 2002, cap.103, p. 1040-1048.

04 )     HUTCHIN, T and CORTOPASSI, G.; Proposed molecular and cellular mechanism for aminoglycoside ototoxicity. Antimicrobial Agents And Chemotherapy, 1994, V. 38, (11) 2517-2520.

05)      PARELLA, M. M., COSTA, S. S., CRUZ, O. L. M., Doença de Méniére e outras vestibulopatias periféricas. In: COSTA, S. S. et alI. (eds.) Otorrinolaringologia Princípios e Prática, 1 ed, Porto Alegre - RS, Artes Médicas Sul, 1994, capo 25, p. 238-248.

05)      VERHELLST, S. H. L. et all.; Glycosylation of Ciclitols: Synthesis of Neamine-Type Aminoglycosides. European Joumal of Organic Chemistry. 2004, p.2404-2410.

06)      SONG, B.B., SHA, S. H., and SCHACHT, J. Iron chelators protect from aminoglycoside-induced cochleo- and vestibulo-toxicity. Free Radical Biology And Medicine. 1998. V. 25 (2). p. 189-195.

07)      MUROFUSHI, T., HALMAGYI, G.M., and YAVOR, R.A Intratympanic gentamicin in menieres disease: results of therapy. American Joumal Of Otology, 1997, V. 18, (1), p. 25-27.

08)      CHEN, J. M., KAKIGI, A, HIRAKAWÁ, H., MOUNT, R. J.. HARRISON, R V. Middle ear instillation of gentamicin and streptomicn in chinchillas: morphologic appraisal of selective ototoxicity, Joumal of Otolaryngology 1999, V. 28. N. 3. p. 121-128.

09)      MULLER, M., SMOLDERS, J. W. T.; Hair cell regeneration after local application of gentamicin at the round window of the pigeon, Hearing Research, 1998, V. 120, p. 25-36.

10)      RAUCH, S. O., and O. A S. J. G.; Intratympanic gentamidn for treatment of intractable Menieres disease: a preliminary report. Laryngoscope. 1997. V. 107, (1), p. 49-55.

11)      OWADA, K.; Experimental studies on the toxicity of kanamycin, its hydrolyzed products and neomycin, Chemotherapia, 1962, V. 5, p. 277-293.

12)      MARTIN, A. R.; Antibacterial antibiotics. In: DELGADO, J.N.; and REMERS, W.A. (eds.) Textbook Of Organic Medicinal And Pharmaceutical Chemistry, 5.ed, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1998, cap.10, p. 291-299.

13)      SEGAL, A. J., SKOLNICK, P. Polyamine-like actions of aminoglycosides and aminoglycoside derivatives at NMDA receptors. European Joumal of Phamacology, 1998, V 34, p. 311-317.

14)      FORD, J. H., BERGY, M. E., BROOKS, A A, GARRETT. E. R., ALBERTl J., DYER, J. R. CARTER, H. E.; Further Characterization of Neomicin B and neomicin C, Joumal of the American Chemical Society, 1955, V. 77, p. 53115314.

15)      BOTTO, R. E., COXON, B.; Nitrogen- 15 Nuclear Resonance Spectroscopy of Neomicin B and Related Aminoglycosides, Joumal of the American Chemical Society, 1983, V.105, p. 1021-1028.

16)      LEACH, B. E.; TEETERS, C. M.; Neamine, an Antibacterial Degradation Product of Neomycin. Journal of the American Chemical Society, 1951, 73,(6), 2794-2797

17)      LEACH, B. E.; TEETERS, C. M. The Identy of Neamine and Neomycin A. Journal of the American Chemical Society, 1952, 74, (12),3187-3188.

18)      ALPER, P. B., HUNG, S. C., WONG, C. H.; Metal Catalyzed Diazo Transfer for the Synthesis of Azides from Amines, Tetrahedron Letters, 1996, V. 37, (34), p. 6029-6032.

19)      KUMAR, V., REMERS, W. A; Aminoglycosides Antibiotics. 1. Regiospecific Partial Synthesis of Ribostamycinad Butirosin B. Joumal of Organic Chemistry, 1978, V. 43, (17), p. 3327-3331.

20)      UMEZAWA, S., OKAZAKI, Y., TSUCHIYA, T.; Studies on Aminosugars. XXXI. Synthesis of 3,4-Dideoxy-3-enosides and the corresponding 3.4Dideoxysugars. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1972, V. 45. (12), p. 3619-3624.

21)      JIKIHARA, T., TSUCHIYA, T., UMEZAWA, S . UMEZAWA, H.. Studies on Aminosugars. xxxv. Synthesis of 3,4-Dideaxyneamine and 3- and 4.-Methylneamines. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1973. V 46. p. 3507 -3510.

22)      GROVE, O. C., RANOALL, W. A Assay Melhods of Antibíotics: A Laboratory Manual (Antibiotics Monographs, 02) Medical Encyclopedia Inc, New York, 1955.

23)      KEMP, D. T., Stimulated acoustic emíssions from withín the human audítory system. Journal of the Acoustical Society of America, 1978, V. 64, N. 5, p. 1386-1391.

24)      HAREL, N., KAKIGI, A, HIRAKAWA, H., MONT, R J., HARRISON, R V., The effects of anesthesia on otoacoustic emissions, Hearing Research, 1997, V. 110, p. 25-33.

25)      SOCKALINGAM, R, FREEMAN, S., CHERNY, L, SOHMER, H., Effect of High-Dose Cisplatin on Auditory Brainstem Responses and Otoacoustic Emissions in Laboratory Animais, The American Joumal of Otology, 2000, V. 21, p. 521-527.

26)      DEMARCO, R.C. Uso da gentamicina intra-timpânica para induzir ablação vestibular unilateral em cobaias. 2001, 99 p.  Dissertação (Mestrado), Faculdade de Medicina, Ribeirão Preto-Universidade de São Paulo, 2001.

27)      SAITO, T.; MANABE, Y.; HONDA, N.; YAMADA, T.; YAMAMOTO, T.; SAITO, H. Semi quantitative analysis by scanning electron microscopy of cochlear hair cell damage by ototoxic drugs. Scanning Microsc, Chicago, v.9, n.1, p.271-80, 1995.

Tabela 1: Dano aos tecidos Cocleares e vestibulares induzidos pela neomicina e seus derivados analisados por ensaios eletrofisiológicos, funcionais e histopatologicos.

* Compostos: Neomicina, Neamina e N-metil-neobiosamidina.

** % de Lesão coclear em 06 animais (100%).

*** Valores dos Limiares em dB para respostas do PEATC em 5, 30 or 60dB, para concentrações de 0,22 mmol/mL..

**** Respostas da OEA-PD.

FIGURAS E ESQUEMAS

FIGURA 1

Figura 2A

Figura 2B,C

Figura 3

Figura 4

LEGENDAS:

Tabela 1: Dano aos tecidos Cocleares e vestibulares induzidos pela neomicina e seus derivados analisados por ensaios eletrofisiológicos, funcionais e histopatologicos.

Esquema 1: Fragmentação química do sulfato de neomicina, resultando em neamina e N-metil-neobiosamidina.

Figura 1: Microscopia eletrônica de varredura da mácula utricular da cobaia tratada com N-metil-neobiosamidina. Notar as alterações ciliares com desarranjo e fusão dos cílios remanescentes e a evidente presença de substância globular, indicando lesão celular (3500 x de aumento).

Figura 2 A, B, C: A) Microscopia eletrônica de Varredura da espira basal da cóclea de cobaia tratada com N-metil-neobiosamidina. Notar a presença de células ciliadas externas e internas com características morfológicas preservadas (Espira basal 750 X de aumento). Em B observa-se a resposta presente das emissões otoacústicas por produtos de distorção (OEA-PD) na orelha direita tratada com injeção intratimpânica de N-metil-neobiosamidina. Em C Observa-se o limiar eletrofisiológico do Potencial Evocado Auditivo de Tronco Encefálico (PEATC) em 5 dB na orelha direita testada.

Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura da espira basal da cóclea de cobaia tratada com neomicina. Notar as alterações nas células ciliadas externas nas 03 fileiras de células, com destruição de todos os cílios e distorção dos cílios das células ciliadas internas remanescentes (espira basal com aumento de 500 X). O mesmo padrão foi observado nas cobaias ytratadas com neamina.

Figura 4: Microscopia eletrônica de superfície da mácula utricular da orelha direita de cobaia tratada com injeção intratimpânica de neamina. Notar a presença das células ciliadas vestibulares com seus estereocílios e quinocílio, com ausência de substância globular (aumento de 3500 X).