Instituto de Higiene da Faculdade de Medicina da Universidade de S. Paulo

(Diretor: Prof. Geraldo de Paula Souza) Hospital de isolamento de S. Paulo (Diretor: Dr. José Augusto Arantes;)

Múltiplos são os processos que o Laboratório nos apresenta para o diagnóstico da Difteria.

O seu agente etiológico : o Corynebacteriuln diphteriae ou Bacilo de Klebs-Loeffler, cresce facilmente na maioria cios meios, principalmente nos que teem como base infusão de carne, com o seu maior desenvolvimento ao redor de 0,5o7o de alcalinidade, expresso em termos de N/1 de hidróxido de sódio. Adicionando-se ao meio proteínas animais sob qualquer forma, com sôro sanguíneo ou todo o sangue, líquido ascítico, o crescimento dos germes apresenta maior fertilidade.

Para o seu diagnóstico, alêm do esfregaço simples de que o próprio clínico pode lançar mão, embora sujeito a muitas falhas, muitos outros processos existem, mais delicados e mais da alçada do analista e baseados no cultivo do material suspeito em meios especiais.

Qualquer meio de cultura deve satisfazer a duas condições essenciais

1.º) facilitar o crescimento do C. diphteriae ;

2.º) reter ou impedir o desenvolvimento dos bacilos pseudo~ diftéricos e outras bactérias coexistentes.

Passaremos em revista os meios de cultura mais importantes para o bacilo diftérico, tais como: o clássico e alguns novos baseados no seu poder de eletividade, de seletividade ou de precisão.

Processo clássico

É o processo de Loeffler e de uso mais corrente, embora o mais antigo (1884).

O seu meio é de preparação facil, tendo como elementos sôro de sangue, geralmente de boi, e caldo de carne glicosado a 1%

Nêste processo, o tempo ótimo para o exame do C. difterias situa-se apoz incubação de 18 a 24 horas, representando esse tempo a zona "maneável", a faze "útil" do processo. Nesse tempo, as colônias são visíveis e apresentam-se pequenas, regulares, acinzentadas, mais opacas no centro, de aspeto delicado e seco, avolumando-se lentamente nas horas seguintes. Uma incubação mais demorada torna-se prejudicial, pois, de acordo com os experimentadores, a rica flora microbiana da semeadura rino-faringea, antes inibida, passa a se desenvolver ativamente e cada vez mais, dificultando, destarte, o exame. Além disso, por este processo dificilmente se obtem uma cultura pura, pois não apresenta ele uma seletividade suficiente, alêm de não retardar o crescimento dos bacilos pseudo-diftéricos.

Pelo exame microscópico, usando-se os corantes adequados, este processo permite, segundo estatística de Melnotte, resposta rápida em 24 horas em 66%, e em 48 horas em 34% dos casos.

Processos novos

Diante da relativa lentidão com que os processos antigos apresentam seus resultados, surgiram novos processos destinados a aumentar a rapidez da resposta, conservando-lhe a precisão.

Modificaram-se os meios de cultura no sentido de ou tornar bem característico o aspecto macroscópico das colônias, o qual pôde, algumas vezes, dispensar o exame microscópico dos germes ou de melhorar-lhe o rendimento sob o ponto de vista diagnóstico. Deste modo, a resposta permite uma terapêutica mais rápida e uma profilaxia mais eficaz.

Em relação aos meios utilizaram-se processos que aumentam

a) a sua eletividade, facilitando o desenvolvimento do b. diftérico;

b) a sua seletividade, opondo-se ao desenvolvimento de outros germes; e

c) a sua precisão, à custa de indicadores corados, assinalando uma viragem típica das colônias diftéricas.

a) Eletividade

A eletividade dos meios pôde ser obtida pelo sôro modificado pela adicção seja de glicerolato de líquidos albuminosos (Poppe) ou de lecitina (Calcaterra) ; seja, após tratamento por soda a 1570 e neutralização, pela adicção de gelose (Klein, Thompson) ; seja pela adicção de gelose apoz ação da tripsina (Douglas, Parker) ; seja ajuntando branco de ovo (Pergola) ; seja ajuntando cistina que facilita grandemente o desenvolvimento do b. diftérico.

Pode-se, ainda, substituir o sôro pelo branco de ovo alcalino e associado ou não à gema do ovo (Bifalco) ; ou ainda, aos meios gelosados com sangue mais ou menos transformado, adiccionar gelose-sangue aquecido ou gelose "chocolate" de Anderson, Happold, Mac Leod e Thompson ; gelose-ascite-sangue coagulado de Gratch ; gelose-sangue coagulado, glicerolato de sangue de Clauberg; gelose e hematina de Kowacs; gelose e extrato hepático de Steigler.

Todos os produtos destes meios são de origem animal, mais ou menos modificados por um tratamento prévio (aquecimento, hidrolise, coagulação, maceração glicerinada).

O meio de gelose "chocolate" de Anderson e colaboradores (1931) já representa progresso sensível no cultivo do b. diftérico, pois, além do isolamento do germe, permite tambem diferenciar lhe os "tipos" bem definidos entre as amostras isoladas dos diferentes casos humanos.

Segundo Arlindo de Assis (Rio de janeiro), quando o meio de cultura é preparado conforme indicam seus AA., o crescimento do germe é satisfatório embora menos rápido e abundante que no sôro Loeffler.

As colônias, no meio de Anderson, desenvolvem-se com um dos 3 seguintes aspectos:

a) de contornos irregulares, similhando uma espécie de margarida, bem crescidas, de coloração cinzo-carregada (tipo "gravis" ou tipo I dos alemães) ;

b) circulares, lusidias, de tamanho pequeno e totalmente negras (tipo "mitis" ou tipo II dos alemães) ;

c) circulares, lusidias, de tamanho pequeno ou médio, de largura variavel e apresentando centro negro dentro de orla clara (tipo "intermédios" ou tipo III dos alemães).

Clauberg explica o desenvolvimento do germe nestes meios pela existência de "fatores de crescimento" que encerram particularmente: o fator X (hematina) ; o fator V (fosfo-pirídino,
nucleotídeos) ; enxofre reduzido (cistina), ácido pimélico, ácido nicotínico.

b) Seletividade

Empregam-se substâncias impedidoras do crescimento de outros germes e inativas, para o b. diftérico, entre as quais sulfo-cianeto de potássio associado ao carmim neutro (processo de Rankin) ou sulfato de cobre (processo de Pesch e Kramer).

c) Precisão

A existência de colônias diftéricas é assinalada pela viragem de indicadores corados e existentes em meios açucarados e tournesolados, tais como os meios azul "horizon" e Clauberg.

Meio azul "horizon"

O meio azul "horizon", de Costa-Troisier-Dauvergne, é constituido por sôro de cavalo, glicose, tournesol e ácido sulfúrico e repartido em placas de Petri. No fim de 24 horas da semeadura, as colônias diftéricas se apresentam grossas como cabeça de alfinete, vermelhas no centro e róseas na periferia, muito transparentes e, vistas com uma lupa através de uma janela, dão a imagem duma pequena cruz. Ligeiramente globosas de consistência firme, escavam-se no centro.

Por este processo podemos ainda distinguir as colônias diftéricas das difterimorfas que são mais opacas e apresentam-se branco-acinzentadas, diferenciação esta que se torna mais- acentuada no fim de algumas horas.

Entretanto, como as colônias estafilococicas neste meio viram também para o vermelho, deve-se fazer o exame microscópico.

Meio de Clauberg

E o unico usado em muitos Institutos de Higiene europeus. Os elementos necessários para este método, segundo Johan e Tomcik, são: gelose a 3% ; sangue coagulado de boi (uma parte de sangue desfibrinado e 2 de agua destilada esteril - usar mistura recente) ; glicerolato de sangue (2 partes de sangue desfibrinado e uma de glicerina quimicamente pura; esta mistura deve ser "amadurecida" pelo menos 6 semanas na geladeira antes do uso, podendo aí ficar em seguida indefinidamente e servir ulteriormente) ; solução de telurito de potássio a 1%, filtrado na vela de Berkefeld ; solução de cistina ; dissolver a cistinanuma quantidade 10 vezes maior de soda, e com água destilada concentra-la a 0,1%.

As quantidades desses elementos são: 750 cc. de sangue coagulado, 40 cc. de glicerolato de sangue; 35 cc. de telurito de potássio a 1%, 35 cc. de cistina a 0,1%; agitar cuidadosamente e empregar a mistura imediatamente, pois ela não se conserva mais do que 3 - 4 dias na geladeira. Aquecer esta mistura a 45º e ajuntar-lhe 850 cc. de gelose a 45º. Agitar e repartir em placas de Petri, devendo o meio ser translúcido e encarnado. Deve ser empregado após longa permanência em estufa para eliminação da água de condensação. O meio conserva-se facilmente 15 dias a 1 mês na geladeira.

Melnotte cita uma recente simplificação deste meio proposta por Gundel e Tietz, permitindo obte-lo sem esperar as 6 semanas de "amadurecimento" do glicerolato de sangue. Misturam-se 1.000 cc. de gelose de Ph = 7,5, 40 cc. de solução de telurito de potássio a 1 To, 1 cc. de solução de cistina a 1% e 100 cc. de sangue desfibrinado de cavalo, de carneiro ou coelho.

No meio de Clauberg (tombem conhecido por Clauberg III) as colônias diftéricas aparecem após 15 - 18 horas sob a forma de pequenas colônias de 1 a 2 milímetros de diâmetro, circundadas por halo azul carregado, arredondadas, regulares, pardas, muito duras e ligeiramente superelevadas no centro que é corado de pardo carregado, o meio exala cheiro aleáceo. Os bacilos pseudodiftéricos ou não alteram a cór do meio ou aparecem cercados por uma zona amarelo-alaranjada. Clauberg, entretanto, assinala apenas 2 germes capazes de produzir certa confusão com o b. diftérico. Um coco que dá colônia pardo-azulada (e não azul escura) caminhando um pouco para o castanho ou violeta, e um cogumelo cuja colônia branca é muito saliente (muitas vezes hemisféricas) e se distingue sem dificuldade da colônia preta, aderente e inteiriça do b. diftérico.

O meio de Clauberg oferece, segundo Hettche, as seguintes vantagens:

1) Rapidez: - O C. diphteriae desenvolve-se em 15 - 24 horas; as culturas negativas são, pois, eliminadas em 80ojo dos casos no fim desse tempo pelo simples exame macroscópico, o que significa rendimento de tempo apreciavel em casos de exames numerosos (e por este processo podem-se fazer até 1.000 exames por hora). Os resultados positivos seriam, no fim de 48 horas, somente de 0,24%, conforme observou Candellini.

2) Precisão: - O aspecto macroscópico permite não só distinguir o b. diftérico como precisar-lhe o tipo ("gravis", "mitis" e "intermedius") com características especiais.
Melnotte, em seus estudos com esses métodos novos obteve macroscópicamente uma resposta rápida em 24 horas em 93,670 dos casos e em 48 horas em 6,4%, resposta obtida com precisão examinando-se somente o aspecto macroscópico das colônias.

Entretanto, os estudos com o meio de Clauberg prosseguiram e, em 1932, Horgan e Marshall (segundo Manzullo) simplificaram-lhe ainda mais a preparação, aumentando fortemente a porcentagem de telurito de potássio, com o qual asseguram um maior retardo do crescimento dos bacilos pseudo-diftéricos.

Consiste esse novo meio de carne com peptona Parke Davis e esterilizado, mais 1,5 cc. de solução aquosa a 2% de telurito de potássio (preparada sem aquecer e não esterilizada) e 1,5 cc. de sangue desfibrinado de boi, recolhido asseticamente, resultando uma concentração final de telurito de potássio igual a 0,16%.

Esta mistura, que deve ser feita no momento do uso, é repartida asseticamente em tubos de ensaio (2cc. em cada um). O tampão esterilizado e carregado com o material suspeito é mergulhado no tubo contendo meio de cultura e colocado inclinado. Leva-se à estufa a 37º e depois de 3 horas examina-se o chumaço que, no caso de existir b. diftérico, se apresenta com manchas pretas nas partes em que ha colônias diftéricas. Manzullo utilizou este processo em 100 casos, dos quais 94 foram positivos por este método, por outros e confirmados clinicamente.

Será este processo novamente por nós referido em capitulo posterior.

Confronto dos processos

No uso dos novos processos existem, sobre o clássico, vantagens incontestáveis de rapidez e precisão.

a) Rapidez: - O emprego dos meios de sangue telurito, tipo Clauberg, permite obter rapidamente, em 15 - 24 horas, grande porcentagem de positividade. A leitura macroscópica representa grande economia de tempo. A existência de colônias, desde a primo-cultura, facilmente isoladas, permite imediatamente uma colônia pura. O diagnóstico rigoroso (reconhecimento isolamento e identificação) do b. diftérico pode ser feito em 24 horas e terminado em 62 horas desde a primeira semeadura, vantagens estas que não existem no processo clássico onde se necessitaria, no mínimo, de 96 horas para um diagnóstico rigoroso.

b) Precisão: - Pelo aspeto das culturas nos meios de sangue-telurito, hemólise e, sobretudo, pelas provas de fermentação do amido e do glicogênio precisam-se não somente a presença do germe diftérico como tambem seu tipo, este melhor evidenciado nos meios de sangue-telurito. Com tudo, o exame macroscópico não dispensa um futuro exame microscópico.

Analisando e comparando esses varios processos vemos que, si de um lado são relativamente fáceis, de outro apresentam um inconveniente comum (menos os de Horgan e Marshall e Manzullo - este último constituindo a segunda parte dêste trabalho), qual seja a demora da resposta: 15 - 18 - 24 - 48 horas após a semeadura, havendo um ótimo entre 18 a 24 horas.

Ora, de acordo com a soroterapia anui-diftérica, sabemos que é necessário injetar sôro o mais cedo possivel. Tanto mais cedo é administrado o sôro - e alguns médicos, em anginas de falsa membrana, não esperam o resultado do Laboratório - tanto mais cedo se retem a evolução da doença e suas consequências, pela neutralização das toxinas. E' o principio da soroterapia anti-diftérica : ser precoce e intensiva.

E como para uma terapêutica rapída não se faz mister apreciar a virulência do bacilo isolado, mas somente saber-se de sua existência, surgiu a preocupação dos analistas em idear processos que permitam uma cultura rápida do germe, conservando-lhe, o tanto quanto possivel, a precisão necessária.

Assim, Folger apresentou em 1902 na Sociedade de Medicina de Kãrtner uma prova que, tendo ficado por muito tempo esquecida, foi reavivada por Sole e que, de modo rapido e facil, nos permite dentro de 2 horas já ter um resultado satisfatório e em bôa porcentagem, em cotejo com o processo de Loeffler e os novos.

E' a prova conhecida com o nome de

PROCESSO DE FOLGER

Com o fim de estudar esse processo rápido, praticamo-lo em 100 casos, comparativamente com o de Loeffler, tomado como padrão.

Técnica: - A sua técnica é simples e pode ser praticada por todo médico

O chumaço esteril de um estilete destinado à colheita do material é introduzido, antes de ser usado, em sôro que não deve conter anticépticos. Folger usou sôro de boi; Sole usou sôro de cavalo; Cesak, sôro humano. Usamos Lambem sôro humano por ser de mais facil obtenção em condição esteril e porque oferece melhores condições de crescimento dos germes e melhores resultados para as granulações de Neisser, segundo Cesak.

Em seguida, passa-se o chumaço embebido no sôro sobre a chama até coagula-lo superficialmente, o que se verificará com a formação de pequenos vapores.

Este tampão ou chumaço assim preparado representa o meio de cultura, com o qual se retirará, em seguida, o material, qualquer que seja a sua localização.

Feita a colheita, introduz-se o tampão contendo a cultura num tubo esterilizado e leva-se à estufa a 37 graus onde ficará durante 2, 4 e 6 horas, fazendo-se nesses tempos esfregaços com o chumaço todo.

Na falta de estufa àquela temperatura podemos usar banho-maria ou outra maneira de obter calor que possa ser regulado. Alguns AA. acham que pôde ser guardado no bolso do colete ou paletó do medico durante o tempo indicado.

No inicio, porêm, de nosso trabalho procuramos modificar essa técnica utilizando chumaços secos e humidos.

O chumaço seco correspondia a chumaço embebido no soro de cavalo, coagulado na chama, com o qual chumaço colhia::os o material e fazíamos esfregaços após 2 - 4 - 6 horas de estufa a 37º.

O chumaço humido correspondia. a chumaço embebido no sôro humano, coagulado na chama, com o qual chumaço retirávamos o material. Este chumaço era agora introduzido no sóro humano e êste sôro examinado em esfregaço após 2 - 4 - 6 horas de estufa a 37.º

Entretanto, alguns dias após as primeiras observações concluimos que o processo do chumaço humido não apresentava resultados satisfatórios tanto quanto o do chumaço seco; passámos então a usar este ultimo, examinando o esfregaço diretamente feito com o chumaço; dentro dessa prática, utilizando, pois, a técnica indicada por Cesak, procuramos substituir o soro de cavalo pelo humano devido às já assinaladas qualidades dê-,te.

Dêste modo, preparávamos os chumaços embebidos no sôro humano e depois de ligeiramente coagulado eram conservados em geladeira e no dia seguinte procedia-se à colheita do material, cujo número subiu 4, 100 para facilidade de cálculo. O material pode ser colhido imediatamente após a preparação do chumaço,

Nos Estados Unidos, Brahdy, Lenarsky e Smith praticaram o método de Folger usando sóro de cavalo, em casos de difteria clinicamente positivos e em casos com lesões membro nossas devidas a outros agente. Acharam, como Sole, nos casos de difteria clinicamente positivos cerca de 80% para o b. diftérico no fim de 2 horas. Acharam ainda que o período ótimo de incubação é de 4 horas.

Assim, em 65 colheitas de casos positivos clinicamente, 64 eram positivos pelo processo rápido, depois de 4 horas de incubação e positivos tambem pelo Loeffler. A positividade, por tanto, atingiu quasi 100%. Em nenhum caso se verificou positividade no Loeffler e negatividade no Folger.

Cesak, que aplicou esse processo em 557 materiais, não ponde verificar, após 2 horas de estufa, resultado de fato positivo, pois não se apresentavam os bacilos com as granulações de

Neisser, as quais estavam presentes após 4 horas de estufa, e após 6 horas não havia mais mudança nenhuma.

Eis a tabela dos resultados de Cesak:





Apresentaremos, a seguir, no Gráfico n." 1 os resultados obtidos nas nossas 100 observações com o processo de Folger, tendo como padrão o de Loeffler. E no Gráfico n." 2 faremos o cotejo dêsses mesmos resultados

Praticamos, como combinações possíveis dos processos de Folger como quando negativos, se pode ver rio Gráfico n." 1, todas as entre os resultados dos vários tempos e do Loeffler, tanto quando positivos, de um ou de outro processo utilizado.
Estabelecidas essas ra, algumas conclusões combinações, são-nos permitidas, ago

1.º) Nenhum dos processos empregados é absoluto: de fato, caso praticássemos exclusivamente o Loeffler (que pelos nossos dados se mostrou o mais sensível), deixariam de ser computados

a) 11 casos positivos que apareceriam associando-o ao Folger 2 horas: (1F2) ;

b) 9 casos positivos que apareceriam associando-o ao Folger 4 horas: (1F4) ;

c) 5 casos positivos que apareceriam associando-o ao Folger 6 horas: (1F6) ;

d) 1,3 casos positivos que apareceriam associando-o ao Folger 2hs. e Folger 4hs.: (1F2F4) (1F2f4) + (1f2F4) ;

e) 11 casos positivos que apareceriam associando-o ao Folger 2hs. e Folger 6h.: (1F2F6) + (1F2f6) + (1f4F6) ;

f) 9 casos positivos que apareceriam associando-o ao Folger 4hs. e Folger 6hs. : (1F4F6) + (IF4f6) + (1f4F6) ;





g) 13 casos positivos que apareceriam associando-o ao Folger 2hs., Folger 4hs. e Folger 6hs.: (1F2F4F6) + (1F2F4f6) + (1F2f4F6) + (1F2f4f6) +(1f2F4F6) + (1f2F4f6) + (1f2f4F6).

Si êste fato se dá com o processo de Loeffler, o mesmo se verificará, e com maior evidência, para os outros processos.

2.º) Si associarmos os resultados apresentados, seja em a) e e), seja em b) e f), seja em d) e g), seja em a), d) e g) da primeira conclusão, concluiremos imediatamente que a associação do Loeffler ao Folger 2 horas ou do Loeffler ao Folger 4 horas dispensa a feitura de Folger 6 horas, pois não se obteve nenhum caso de Loeffler, Folger 2 horas e Folger 4 horas negativos e Folger 6 horas positivo (vide Gráfico n.º 1: (1f2f4F6 = 0) ;

3.º) A associação concomitante do Loeffler e Folger 2 horas: não dispensa a feitura de Folger 4 horas, pois, assim procedendo, deixariam de ser computados dois resultados positivos (Gráfico n.º 1: (1f2F4 = 4) (comparem-se b) e d) da primeira conclusão) ;

4.º) A realização concomitante de Loeffler e Folger 4 horas. não dispensa a feitura de Folger 2 horas, pois, assim procedendo, deixariam de ser computados quatro resultados positivos (Gráfico n.º 1: (1f2F4 = 4) (comparem-se b) e d); da primeira conclusão) ;

5.º) As conclusões 3.a) e 4.a) permitem-nos afirmar que, para maior garantia de diagnóstico, devem ser realizados o Loeffler, Folger 2 horas e Folger 4 horas; "este resultado demonstra que o processo de Folger (que absolutamente não dispensa o de Loeffler, pois êste meio revela dezeseis resultados positivos que nenhuma das variedades do Folger o fez - (Gráfico n.º 1: (Lf2f4f6 = 16), possue, alêm da vantagem de rapidez, a de constituir um auxiliar diagnóstico, dentro das condições de exame por nós realizadas.

Si considerarmos como positivos todos os casos em que ao menos um dos métodos deu resultado positivo - critério adotada. como meio diagnóstico em Laboratório, porquanto ele implica na existência e vitalidade do :germe - o total de positivos se eleva a oitenta e dois.

E o que se pôde verificar efetuando-se a soma dos seguintes, dados do Gráfico n:º 1:
(L = 69) -}- (1F2 = 11) + (1f2F4 = 2) + (1f2f4F6 =0) = 82


Temos, portanto, como porcentagem de positividade pelos diversos processos sobre o total dos casos bacteriologicamente positivos

Loeffler 69%/82 = 84,1570, mais ou menos 4,03 (erro padrão)
Folger 2hs. 58%/82 = 70,7370, mais ou menos 5,02 (erro padrão)
Folger 4hs. = 53%/82 = 64,6370, mais ou menos 5,28 (erro padrão)
Folger 4hs. = 47%/82 = 57,3270, mais ou menos 5,46 (erro padrão)

Procuramos, a seguir, verificar si as diferenças tomadas 2 a 2 podiam ou não ser atribuidas à flutuação de amostras simples, partindo-se do fato de que para se estudar a influência do acaso se supõem verificadas as condições de simplicidades de amostras e, então, relaciona-se a diferença com o erro padrão obtido sob tal hipótese.

Quando tal relação é maior ou igual a 3 pode-se afirmar, com certeza prática, que O acaso não pode ser invocado para explicará. Em caso contrário, só é possivel falar-se em probabilidades da diferença ter um valor significativo.

Assim, obtivemos os seguintes resultados (Gráfico n.º 3)





Estes resultados nos permitem afirmar:

a) com certeza prática as diferenças entre Loeffler e Folger 4 horas e entre Loeffler e Folger 6 horas não são devidas ao acaso;

b) ha grandes probabilidades das diferenças entre Loeffler e Folger 2 horas e entre Folger 2 horas e Folger 6 horas terem um valor significativo; uma afirmação categórica dependendo, entretanto, de posteriores verificações;


c) é ousada qualquer afirmativa acerca das diferenças entre Folger 2 horas e Folger 4 horas e entre Folger 4 horas e Folger 6 horas.


CONCLUSÕES PINAIS DO PROCESSO DE FOLGER

Procurando resolver uma questão que sempre existiu em Laboratório, isto é, conciliar rapidez e perfeição é que surgiu o processo que ora experimentamos e que se impõe pelo seu valor incalculável á Medicina Prática e ao Laboratório

1.º) pela rapidez dos seus resultados, o que tem importância capital no emprego imediato do sôro específico, e no reconhecimento rápido dos portadores (o mais tardar 6 horas após a colheita), evitando-se, assim, a propagação da infecção;

2.º) pela sua simplicidade, o que o torna ao alcance de qualquer Laboratório e muitos clínicos, permitindo seja utilizado ao lado da semeadura no meio de Loeffler, o que elevará o total de positividade ;

3.º) porque permite ao médico facilmente comparar o estado clínico e a cultura;

4.º) por ser econômico, pois utiliza menos sôro que qualquer meio, o que permite larga aplicação nas epidemias de asilos ou outras localidades onde não se possa fazer o isolamento;

5.º) para maior garantia de diagnóstico devem-se realizar os processos de Loeffler e Folger 2 horas e Folger 4 horas;

6.º) o processo de Folger não dispensa a feitura do de Loeffler, por ser este o mais sensível e do qual aquele é simples auxiliar.

7.º) o processo de Folger, não permitindo uma semeadura ou isolamento dos germes, impede o estudo de seu tipo, sua virulência e sua toxina.

PROCESSO DE MANZULLO

MANZULLO, prosseguindo em seus estudos com o processo de HORGAN e MARSHALL, e que contem - como já vimos à. pagina 8 - urna solução fortemente aumentada de telurito de potássio (27º), verificou que os fragmentos de pseudomembranas arrancadas durante a retirada do material para o exame e aderêntes ao chumaço, enegreciam durante três horas de incubação a 37 graus em todos os casos em que o resultado era positivo para o bacilo de LOEFFLER, ao passo que, quando êste resultado era negativo para difteria não só o enegrecimento aparecia depois de dezoito horas de incubação a 37 graus, como também era menor e muito mais uniforme sobre o chumaço.

Concluiu, por estas observações, que o enegrecimento das pseudo-membranas antecedia muito ao desenvolvimento do Corynebacteriuln diphterix. Praticou, a seguir, experiências para saber à custa de que substância corria tal enegrecimento. E verificou ser devido ao telurito de potássio em solução. Aplicou, então, gotas de uma solução aquosa a 2% desse sal em pseudomembranas diftéricas, "in_ vivo" e "in vitro", e após cinco a dez minutos podia observar o enegrecimento das partes tocadas. O enegrecimento corre por conta da redução do sal a óxido de telúrio.

Destarte, chegou ao seu processo que permite, dentro de um curto espaço de tempo de cinco a dez minutos, obter um resultado satisfatório.

O A. aplicou-o em cotejo com a clínica e com o processo de HORGAN E MARSHALL em setenta e cinco doentes e obteve os seguintes resultados: sessenta e nove concordâncias, isto é, 927º, e seis discordâncias, 87º.

A técnica deste processo de diagnóstico é, pois, muito simples: com um chumaço embebido em solução aquosa de telurito de potássio a 27o tocar as formações exsudativas suspeitas. A leitura deve ser feita cinco a dez minutos após o toque. Si se observar enegrecimento na parte_ tocada, o germe é diftérico e si a coloração se conservar inalterada o resultado é negativo para difteria.

A solução não deve ser usada depois de trinta dias de preparada.

Entretanto, recomenda o seu A. algumas precauções, tais como não tocar a lingua, cuja mucosa enegrece normalmente com telurito, bem como quando houve prévia embrocação com azul de metileno ou gargarejo com agua oxigenada ou acido tânico.

Estas falsas reações, porém, não se repetem desde que cesse a ação dessas substâncias.

Praticamos o processo de MANZULLO em sessenta doentes, muitos diftéricos manifestos internados no serviço especializado do Hospital de Isolamento de S. Paulo e alguns em clínicas oto-rino-laringológicas que frequentamos.

Os resultados por nós obtidos foram os seguintes:





Não procuramos saber o tempo de desprendimento das pseudo-membranas enegrecidas, uma vez que quasi todos os doentes que as apresentavam tinham já recebido conjuntamente o sôro específico.

Fizemos três investigações sobre placas diftéricas que depois de cinco minutos se enegreciam ao toque da solução de telurito. Com grande probabilidade, portanto, os resultados por nós obtidos permitem supor que o enegrecimento "in vivo" e "in vitro" pode ser relativamente específico quando o Corynebacterium diphteria se acha em atividade.

ANALISE DOS NOSSOS RESULTADOS

Porcentagem de Manzullo positivos entre os diagnósticos clinicos positivos - 90,7%.

Porcentagem de Manzullo positivos entre os diagnósticos bateriológico - 92,7%.

Vemos, pois, que a prova de Manzullo apresenta um alto índice de positividade, quer entre os diagnósticos clínicos positivos, quer entre os bacteriológicos positivos. Entretanto, casos houve em que o seu resultado foi falho.

Calculando-se os erros padrões dessas porcentagens, e sendo
- erro padrão da porcentagem de Manzullo positivos entre os diagnósticos clínicos positivos - 4,43%
- erro padrão da porcentagem de Manzullo positivos entre os bacteriológicos
positivos - 3,96 %





Vemos, pois, que, admitindo-se como oscilação possível decorrente das flutuações de amostras simples, os limites de ± 3 < teremos para as porcentagens supra, os valores compreendidos respectivamente entre 90,7% +ou- 13,3% e 92,9% ± 11,9%, ou seja, valor entre 100% e 77,4% e entre 10070 e 81,0%.

Admitindo-se os limites de 2 <, o que já oferece uma grande margem de segurança, obteremos para as porcentagens os limites: entre 99,6% e 81,8% e entre 100% e 85%.

Esses resultados nos mostram que, na pior das hipóteses, 20% dos casos darão resultados do processo de- Manzullo discordantes do diagnóstico clínico positivo, e 15% dos casos darão resultados discordantes dos processos bacteriológicos positivos.

Por outro lado, pudemos verificar que, dentre os casos de diagnóstico clínico negativo e de bacteriológico negativo, o comportamento do processo de Manzullo foi o seguinte:

porcentagem de Manzullo positivo entre os diagnósticos clínicos negativos:

2 X 100 / 17 = 11,8%

porcentagem de Manzullo positivo entre os bacteriológicos negativos:

2 X 100 / 18 = 11,1%


Os < da porcentagem são os seguintes: 7,8% e 7,4% respectivamente, o que nos dará como limites possíveis por flutuação de amostras simples com oscilações destas de ± 2 < entre 27,4% e 0% e entre 25,9 % e 0% respectivamente.

Os resultados obtidos mostram nitidamente que o processo de MANZULLO não pode ser considerado como processo de certeza absoluta para o diagnóstico da difteria, pois, apresentou resultados negativos em casos clínicos e bacteriológicos positivos.

Por outro lado, casos houve em que o processo de MANZULLO foi positivo apezar de terem sido negativos os resultados dos exames clínicos e bacteriológicos; a interpretação destes casos é difícil, pois não dispomos de elementos para assegurar a absoluta especificidade da reação não sendo lícito afirmar-se nem que estes casos sejam na realidade de difteria nem que sejam negativos; pode dar-se o caso ainda de se tratar de portadores do Corynebacterium difterias, nos quais um processo anginoso de outra natureza se tenha estabelecido; esta última hipótese não daria explicação satisfatória para a negatividade do exame bacteriológico que deveria, neste caso, ser positivo.

CONCLUSÕES FINAIS DO PROCESSO DE MANZULLO

1.º) O processo de MANZULLO constitue elemento de bastante rapidez e eficiência para o diagnóstico da difteria "ia. vivo" e "ia. vitro";

2.º) O seu emprego, como complemento das provas usuais bacteriológicas, não oferece vantagens, pois, os casos em que ele é positivo, sendo as provas bacteriológicas negativas, não podem ser tomados em consideração, uma vez que não apresenta elemento que aumente a especificidade da reação. O seu uso, entretanto, se justifica somente em casos em que se deseja um diagnóstico rápido;

3.º) O seu emprego, como substitutivo dos processos bacteriológicos, quando estes não podem ser realizados, é indicado não só pela simplicidade da prova, que permite sempre a sua realização, como pelas altas porcentagens de concordâncias dos seus resultados com os de outros processos.

RESUMO

O A. depois de estudar os vários processos de laboratório para o diagnóstico da difteria, passa. a critica-los sob o ponto de vista da positividade, precisão e rapidez de seus resultados. De acordo com a soroterapia antidiftérica que consiste em ser precoce e intensiva, estuda detalhadamente a rapidez dos vários processos e apresenta o processo de Folger, cujos resultados são obtidos 2, 4 e 6 horas após a colheita do material.

O processo em estudo consiste em se tomar um chumaço montado em estilete, ambos estéreis, e introduzi-lo em sôro sanguíneo. Usou o A. o sôro humano por ser de mais facil obtenção em condições estéreis e porque oferece melhores condições de crescimento dos germes e melhores resultados para as granulações de Neisser. Em seguida, passa-se o chumaço embebido no sôro sobre a chama até coagula-lo superficialmente, o que se verificará com a formação de pequenos vapores. Este tampão representa agora o meio de cultura com o qual se retirará, em seguida, o material qualquer que seja a sua localização. Colhido o material, introduz-se o tampão contendo a cultura num tubo esterilizado e leva-se à estufa a 37 graus, onde ficará durante 2, 4 e 6 horas, fazendo-se nesses tempos esfregaço com o chumaço todo.

Praticou 100 análises no Hospital de Isolamento de S. Paulo (Secção de Difteria) em indivíduos clinicamente diftéricos. Confrontou seus exames com o processo classico de Loeffler, tomado como padrão.

Nessas 100 análises obteve os seguintes resultados positivos:

Loeffler 69; Folger 2 horas 58; Folger 4 horas 53 e Folger 6 horas 47 casos. Em estudo estatístico verificou que praticando-se os processos de Loeffler e Folger 2, 4 e 6 horas conjuntamente o total de positividade se elevava para 82 %, emquanto praticado o Loeffler isoladamente era de 69%.

Depois de apresentar gráficos de seus resultados, conclue que o processo de Folger se impõe pelo seu valor incalculável à medicina prática e ao laboratório por ser rápido, simples, por . permitir facilmente comparar o estado clínico e a cultura, por ser econômico.

Chama a atenção para o fato de que para maior garantia de diagnóstico deve-se realizar os processos de Loeffler e Folger 2 e 4 horas; de que o processo de Folger não dispensa a feitura do de Loeffler, por ser este o mais sensível e do qual aquele é simples auxiliar; e de que o processo de Folger, não permitindo uma semeadura ou isolamento dos germes, impede o estudo de seu tipo, virulência e toxina.

Apresenta ainda o processo de Manzullo ideado por êsse A. argentino. Consiste em se tomar um chumaço embebido em solução aquosa de telurito de potassio a 2 % e tocar as formações exsudativas suspeitas. A leitura se faz a 5 a 10 minutos após otoque. Si se observar o enegrecimento na parte tocada o germe é diftérico e si a coloração não se alterar o resultado é negativo para difteria.

A solução não deve ser usada depois de 30 dias de preparada. O seu A. recomenda que a solução não deve tocar a língua, cuja mucosa enegrece normalmente com o telurito, bem como quando houve prévia embrocação com azul de metileno ou gargarejo com agua oxigenada ou ácido Tonico.

Fez 60 observações em indivíduos diftéricos do Hospital do Isolamento de S. Paulo, comparando seus resultados com o processo de Loeffler tomado como padrão.

Obteve 54 casos de concordância do processo de Manzulo com o de Loeffler e o diagnóstico clínico, e 6 casos de discordância. Depois de estudo estatístico com os resultados obtidos, conclue que esse processo é bastante rápido e eficiente para o diagnóstico da difteria "in vivo" e "in vitro"; que o seu uso, como complemento das provas bacteriológicas, não oferece vantagens, mas quando essas provas não podem ser realizadas, o seu emprego é indicado, não só pela sua simplicidade como pelas altas porcentagens de seus resultados com os de outros processos.

RESUMÉ

Après avoir étudié les différentes méthodes de laboratoire pour le diagnostic de la diphthérie, l'auteur en fait la critique du point de vue positivité, exactitude et rapidité des résultats obtenus. Selon la sérothérapie anti-diphthérique dont la caractéristique dont la caractéristique est d'être précoce et intense, il étudie en détail la rapidité d'obtention du résultat par des différentes méthodes et il présente entre autres la méthode de Folger, dont les résultats sont obtenus 2, 4 et 6 heures après le prélèvement du matériel. Cette méthode consiste en l'emploi d'un tampou de cotou monté sur un batonnet stérilisé que l'on imbibe de sérum sanguin. L'auteur s'est servi du sérum humain parce que plus facile à obtenir em état stérile et aussi parce qu'il offre de meilleures conditions de développement des germes et de meilleurs résultats pour les granulations de Neisser. Sans retard on flambe le cotou imbibé de sérum jusqu'à sa coagulation superficielle, ce qui se remarque par la formation de légères vapeurs. Ce tampon représente maintenant le milieu de culture aves lequel on prélève aussitót de l'endroit suspect le matériel à examiner. Après ce prélèvement le coton porteur de la culture est placé dans un tube stérilisé qui est porté a la température de 37º dans l'étuve oü il restera 2, 4 et 6 heures; à la fin de chacune de ces périodes on fera des frottements avec le tampon.

L'auteur a effectué environ cent analyses à l'Hospital de Isolamento de São Paulo (Section de Diphthérie) sur des sujets déjà diagnostiques cliniquement comine diphthériques. II a comparé le résultat de ses examens avec ceux du procédé de Loeffler (procédé classique). Dans les cent cas examinés il a obtenu les résultats positifs suivants:

Loeffler - 69 casos
Folger (2 heures) - 58 casos
Folger (4 heures) - 53 casos
Folger (6 heures) - 47 casos


La statistique démontre qu'en effectuant simultanément les procedes de Loeffler et Folger, on obtient un total de positivité s'élevant à 82 %, alors que la méthode de Loeffler isolée ne donne que 69 %. Après avoir montré des graphiques de ces résultats, l'auteur arrive à la conclusion que le procédé de Folger s'impose a la médecine et au laboratoire par sa valeur incalculable, par la rapidité et simplicité d'obtention des résultats et parte qu'il permet la comparaison de l'étàt clinique et de la culture, et enfin, par le peu de frais qu'il entraine.

L'auteur insiste sur le fait que pour obtenir una plus grande garantie de diagnostic, on doit employer les méthodes de Loeffler et Folger 2 et 4 heures. En effet, la méthode de Folger ne dispense pas de l'emploi de celle de Loeffler, cette drnière étant plus sensible, la première seulement aidant à confirmer le résultat de la seconde. Le procédé de Folger n'est pas complet en lui-méme, car ne permettant pas la semente ou l'isolement des germes, il rend impossible l'étude de type, virulence et toxine.

Il décrit encore le procédé de Manzullo, élaboré par cet auteur argentin. Cette méthode consiste en l'emploi d'un tampon imbibé d'une solution aqueuse de tellurite de potasse à 2% avec lequel on touche les formations exsudatives suspectes. La constatation du résultat s'effectue 5 a l0 minutes plus tard. Si la partie touché est dèvenue noire, le germe est le B. diphtheriae. Si la couleur n'est pas alterée, le résultat au point de vue diphthérique est négatif.

La solution doit étre utilisée dans les 30 jours que suivent sa préparation. L'auteur recommande d'éviter soigneusement le contact de la solution avec la langue dont la muqueuse noircit normalement sous l'action de tellurite, également lorsqu'il y a eu au préalable embrocation de bleu de méthylène ou gargarisme par l'eau oxygenée ou l'acide tannique. Sur 60 observations effectuées dans des cas diphthériques à I'Hospital de Isolamento de São Paulo, employant comine procédé basique celui de Loeffler, il a constaté identité de résultat dans 54 cas entre la méthode de Loeffler et CÁ-Ile de Manzullo et résultats discordants dans 6 cas.

De l'étude statistique des résultats obtenus, l'auteur arrive à la conclusion que cette méthode est assez rapide et efficace pour le diagnostic de la diphthérie "in vivo" et "in vitro"; que son emploi n'offre pas d'intérét comine complément des examens bactériologiques, mais dans les cas oú cet examen ne peut être effectué, son emploi se recommande non seulement par sa simplicité, mais aussi en vue du pourcentage élevé de concordante de ses résultats avec ceux obtenus par les autres méthodes décrites.


SUMMARY

After studying various laboratory methods used in the diagnosis of diphtheria, the author judges their advisability from the point of view of the positiveness, exactness and rapidity with which the results are obtained.

In accordance with the precepts of anti-diphtheric serum-therapy which consists in being both precocious and intensive, he makes a detailed study of the various methods as to their rapidity, and presents Folger's procedure the results of which are obtainable two, four and six hours after the collection of the material. The test is carried out as follows: - A sterile cotton wad twisted around a sterilized rod is soaked in blood serum. The author used human blood serum as easier procurable under sterible conditions and as providing a better medium for the culture of germs besides ensuring better results to the granulations of Neisser. After soaking the wad, it is held over the flame, until a superficial coagulation of the serum sets in, which circumstance is accompanied by the appearance of slight vapours. The wad now constsitutes the culture medium with which the material is collected wherever it may be found. As soon as this has been done, the wad containing the culture, is placed into a sterile tube and kept in the stove at 37º two, four and six hours. After the elapse of each time limit rubbings are made with the entire wad. He carried out tésts in 100 clinicai cases of diphtheria at the Hospital de Isolamento de São Paulo (Diphtheria Section). On comparing his results with those obtained by using the classical method of Loeffler, he obtained the following positive results:

Loeffler - 69 cases
Folger (2 hours) - 58 cases
Folger (4 hours) - 53 cases
Folger (6 hours) - 47 cases

A statistical survey showed that the joint application of the procedures of Loeffler and Folger two, four and six hours respectively, the total positiveness reached amounts to 82 % as against 69 % when using Loeffler's method only.

Substantiating his results by graphs, the author arrives at the conclusion that the use of Folger's procedure is to be preferred on account of the incalculable advantages it offres to both practical medicine and the laboratory, as its execution is cheap, rapid and simples, and also because it permits the comparison between clinicai status and culture. For the sake of greater security he advises the joint use of the methods of Loeffler and Folger two and four hours. He calls the attention to the fact that Folger's procedure does not supplant that of Loeffler, which is more sensitiva, but that it simpey constitutes an auxiliary test. Besides, Folger's method does not permit the sowing or isolation of germs, thus making fhe study of type, virulence and toxin an impossibility.

Furthermore, he also presents the method elaborated by Manzullo, ali Argentine author. According to this a cotton wad is soaked in an aqueous solution of potassium telluride 2 To and with it the suspected exudative arcas are swabbed. The readings are made five to ten minutes after 'the embrocation. The germ in question being the B. diphtherial the embrocated arcas will have become black, otherwise there will be no alteration in colour.

The sMution only to be used within lhe thirty days following its prepakatioth. The author recomends that cate be taken not to touch the mucous membrane of the tongue which natucally blackens at coming into contact with telluride, the same applying to application of metlylene blue or gargles with oxygenated water or tannic acid. The above procedure has been used in sixty cases at the Hospital de Isolamento de São Paulo, Loeffier's method furnishing the test. Both processes gave the same result in 54 cases, in six instantes they differed. Taking into consideration the results obtained, he arrives at the conclusion that the procedure of Manzullo is fairly rapid and efficient as far as the diagnosis of diphtheria "in vivo" and "in vitro" is concerned, but that its use as a complement to bacteriologic tests offers no advantage. However, should it be impossible to resort to the latter, its application is advisable on account of its simplicity and the high percentage of identical results obtained by ít when compared to other methods.

BIBLIOGRAFIA

1. WILLIAN FORD - "Text-Book of Bacteriology" London. 1929. 2. HIZZ-ZINSSER - "Text-Book of Bacteríology" London. 1929.
3. MAX CHRISTSANSEN - "Le bacille de la Diphterie" - Paris. 1923.
4. L. CARRIERE - "La diphterie" - Paris. 1939.
5. Dr. GERT CESAK - "Diphterias chnellkultur nach Folger" - in "Deutsche Me
dizinische Wochenschrift - august 1937.
6. BRAHDY, LERNASK, SMITH - "A rapid method for identification of Diphteria Bacilli", in "Journal of American Association" - Vol. 144 n.o 21. Chicago - 1935.
7. A. MANZULLO - "Nuevo methodo para el cultivo dei C. dipitterix y nuevo methodo para el diagnostico de 1a diphteria del hombre", in, "Folia Biologica" - Maio-Agosto 1938 - Buenos Aires.

DR. SILVIO MARONE
R. Penaforte Mendes, 267 S. PAULO

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(1) Trabalho apresentado na Secção de O. R. L. da Associação Paulista de Medicina em 17-3-41.
(2) Oto-rino-laringologista da Clínica da Faculdade de Medicina (Ia Universidade de S. Paulo, da Policlínica de S. Paulo e do Ambulatório Sta. Luisa.
(3) Foi usado o processo clássico dê Loeffler.