INTRODUÇÃO

A cisplatina é uma potente droga antineoplásica utilizada em larga escala tanto em adultos quanto em crianças na terapia do câncer avançado. Muitos de seus efeitos colaterais são irreversíveis e podem ser monitorados clinicamente, mas freqüentemente não podem ser evitados. Diversos estudos têm sido conduzidos no intuito de descobrir drogas que, associadas a cisplatina, possam evitar os efeitos indesejáveis desta.1-9

A toxicidade da cisplatina tem sido verificada tanto em nível renal, como do sistema nervoso central ou periférico, toxicidade gastrointestinal e da medula óssea e, assim como outras classes de medicamentos, causa lesões ao órgão de Corti, sendo considerada uma droga ototóxica.1,2,4,7,8

Estudos anatômicos demonstram que a cisplatina provoca danos tanto com doses agudas elevadas como com doses cumulativas, principalmente com o comprometimento de células ciliadas externas, havendo lesão inicial nas células da espira basal da cóclea. Alguns autores sugerem a ocorrência de um bloqueio na transdução dos canais de cálcio destas células, outros estudos mostram lesões às células ciliadas internas, às células suportes e "stria vascularis", bem como o gânglio espiral.10-17

A cisplatina causa uma perda auditiva bilateral e irreversível em humanos, com zumbido associado e comprometendo as altas freqüências (4.000 Hz a 8.000 Hz).1,2,4,8,18

As formas de se estudar os efeitos da toxicidade coclear têm se dirigido às alterações eletrofisiológicas detectadas pelo Potencial Evocado de Tronco Cerebral (BERA) e Potencial Endococlear.2,4,5,15,16,19-21

As emissões otoacústicas, detectadas por Kemp (1971) no conduto auditivo externo de humanos, medem o "feedback" de energia biomecânica na contração das células ciliadas externas, que amplifica o pico da "onda viajante" na membrana basilar e têm aplicação clínica na avaliação da integridade auditiva.16,21-25

Como a cisplatina atua inicialmente causando lesões nas células ciliadas externas, as emissões otoacústicas seriam um método de avaliação simples e rápido de tais danos, podendo inclusive participar na monitorização de pacientes submetidos a drogas consideradas ototóxicas.16,21-26
Estudos têm demonstrado um possível mecanismo antioxidante para a ototoxicidade e nefrotoxicidade geradas pela cisplatina, pois as vias de detoxicação nos dois tecidos são semelhantes. Autores mostram que os níveis de glutation e a atividade de enzimas antioxidantes como superóxido dismutase, catalase, GSH peroxidase e GSH redutase estão reduzidas nestes tecidos, levando a peroxidação lipídica, instalando assim, a toxicidade celular.10,27-34

Diversas drogas têm sido testadas com o objetivo de otoproteção como o tiossulfato de sódio, o dietilcarbamato, o ACTH e derivados, o ácido 4-metilthiobenzóico, o ácido lipóico, o glutation e seus ésteres, metionina, procaína, hormônio estimulador alfa-melanocítico (melatonina), antioxidantes como a ginkgo biloba e fosfomicina e compostos sulfurados.3,5,6,9,35-47

Trabalho recente de tese de mestrado da FMRP - USP mostrou que baixas doses de gentamicina levam a um efeito protetor estrutural para as células ciliadas externas, que mantém suas características normais à microscopia eletrônica de varredura quando se aplicam, posteriormente, doses elevadas desta droga, sugerindo assim, que existe um mecanismo de autodefesa - adaptação intra-coclear às agressões induzidas pelas drogas ototóxicas.48-51

O objetivo da investigação é verificar se existe o efeito otoprotetor de drogas que já são utilizadas na prática clínica com outras finalidades como o extrato de ginkgo biloba, aos danos cocleares causados pela cisplatina, utilizando doses de cisplatina sabidamente ototóxicas, lesivas às células ciliadas externas, avaliando-se as alterações anatômicas através da microscopia eletrônica de superfície, e avaliação funcional por emissões otoacústicas - produtos de distorção.

MATERIAL E MÉTODO

Elegemos como animal experimental cobaias albinas, pelo fácil manejo, pela facilidade de dissecção coclear e manipulação, facilidade para vias de infusão para as drogas anestésicas e drogas em experimentação, pela via intraperitoneal ou intramuscular, bem como, porque quando comparada ao rato, por exemplo, é mais sensível aos efeitos da cisplatina, podendo-se manter adequados cuidados, seguindo as normas de cuidados para com animais experimentais.11,12,14,37,52-54
Os animais foram divididos em 4 grupos de estudo:

Grupo 1: 4 animais - 8 cócleas - cisplatina 8,0 mg/Kg/dia (IP) por 8 dias.
Grupo 2: 6 animais - 12 cócleas - Ginkgo biloba 100 mg/Kg via oral e 90 minutos após, cisplatina 8,0 mg/Kg/dia (via intraperitoneal) por 8 dias.
Grupo 3: 6 animais - 12 cócleas - Ginkgo biloba 100 mg/Kg via oral por 10 dias e após Ginkgo biloba 100 mg/Kg via oral e 90 minutos após, cisplatina 8,0 mg/Kg/dia (via intraperitoneal) por 8 dias.
Grupo 4: 3 animais - 6 cócleas - Ginkgo biloba 100 mg/Kg via oral por 8 dias.
Drogas utilizadas:

1. Cisplatina (8,0 mg/ml) - Laboratório Farmacêutico - Eurofarma
8,0 mg/dia via intraperitoneal
2. Xilazina (Coopazine®, Rompun®) 2g/100ml (6,5mg/Kg)
3. Cloridrato de Cetamina (Ketamin®) 50 mg/ml (65mg/Kg)
4. Extrato de ginkgo biloba (EGB 761) - Laboratório Farmacêutico - ByK Química 40 mg/ml (100 mg/Kg/dia)

1. Emissões Otoacústicas por Produto de Distorção
EUIPAMENTO: ILO 92 CAE System Otodynamics LTD.
2. Microscopia Eletrônica de Varredura
Microscópio Jeol - JSM 5200.

Emissões Otoacústicas por produtos de distorção:

As cobaias foram anestesiadas com Coopazine® e Ketamin® para serem submetidas ao teste. Antes da realização do teste foram submetidas a otoscopia manual para avaliação do conduto auditivo externo e membrana timpânica, sendo descartadas as cobaias que apresentaram sinais de otites e as que apresentaram cerume que não pode ser removido.

O teste de emissões otoacústicas por produtos de distorção foi realizado pré tratamento e momentos antes dos animais serem sacrificados, seguindo a relação 2F1 - F2 com relação F1:F2 = 1,22, resolução 1 ponto por oitava.

Microscopia Eletrônica de Varredura 11,33,49,55

As cobaias foram sacrificadas em tempo programado após administração das drogas via intraperitoneal e então sacrificadas após anestesia com éter, tendo sido decapitadas e suas cócleas removidas da bula.
Com dissecção microscópica as cócleas foram perfundidas com solução de fixação com glutaraldeído 3% a 4º Celsius e mantidas na solução por 24 horas para a fixação. Os passos seguintes foram realizados no Laboratório de Microscopia Eletrônica do Departamento de Morfologia da FMRP-USP.

Através da janela redonda foi injetado para fixação uma solução de glutaraldeído a 3% em tampão fosfato 0,1 M, pH = 7,4, por 4 horas a 4º Celsius, lavadas 3 vezes por 5 minutos com o mesmo tampão, após o que foram fixadas com tetróxido de Ósmio 1% por 2 horas a 4º Celsius e submetidos a uma desidratação à temperatura ambiente em uma bateria crescente de etanol (50%, 70%, 90% e 95% - uma vez por 10 minutos em cada concentração) e etanol absoluto 3 vezes por 15 minutos. Terminada a desidratação, seguiu-se para a secagem pelo método do ponto crítico em CO2, onde o material ficou desprovido de água. Após ser fixado em porta espécime adequado, o material foi revestido em câmara de vácua com vapores de ouro e examinados em microscópio eletrônico de varredura.

Foi utilizado o Microscópio Eletrônico JEOL SCANNING MICROSCOPE - JSM 5200.

Os resultados obtidos da microscopia eletrônica de varredura, após fotografados, foram analisados através de cócleogramas (contagem do número de células ciliadas externas da espira basal da cóclea em determinado campo fotográfico) e avaliadas estatisticamente pelo t-test, utilizando o programa estatístico - Primer of Biostatistics (Stanton A. Glantz).

RESULTADOS

Com relação à dosagem de Cisplatina utilizada, em trabalho anterior (dados não publicados), utilizamos a dosagem de 1,5 mg/Kg/dia por 18 dias e não observamos alterações anatômicas nas células ciliadas externas na espira basal da cóclea de cobaias albinas tratadas com Cisplatina, bem como não ocorreram alterações ás emissoes otoacústicas por produtos de distorção pré e pós tratamento. (Figura 1)

A avaliação do estado funcional das células ciliadas externas, estudadas pelas emissões otoacústicas por produtos de distorção, mostraram redução na amplitude nas diferentes freqüências testadas a partir de 2 kHz, sendo as respostas identificadas na zona de ruído no grupo tratado com cisplatina 8,0 mg/Kg/dia por 7 dias. (Figura 2)

Quanto às emissões otoacústicas no grupo 2, tratados com ginkgo biloba previamente a cisplatina, os resultados estão representados na Figura 3.

As emissões otoacústicas por produtos de distorção avaliam o estado funcional das células ciliadas externas na espira basal da cóclea, no entanto, a avaliação é qualitativa. Foram consideradas as emissões otoacústicas por produtos de distorção como presentes e ausentes. Nos grupos 2 e 3 tratados com ginkgo biloba as emissões otoacústicas por produtos de distorção estiveram presentes em todas as orelhas testadas.

Comparando-se os grupos 2 e 3, observamos que o traçado das emissões otoacústicas por produtos de distorção mostraram-se presentes e em níveis de intensidade maiores (dB), mas os dados não puderam ser testados estatisticamente.

Entre os grupos 1 e 2 e 1 e 3 as emissões otoacústicas por produtos de distorção estiveram ausentes em todas as orelhas do grupo 1 (n= 8), com diferença estatisticamente significante. (Fisher exact test: p = 0,003)

Quanto à avaliação anatômica, no grupo tratado com cisplatina isolada (8,0mg/kg/dia) houve lesão com ausência de cílios nas 3 fileiras de células ciliadas externas a nível da espira basal, seguida da espira 2 e espira 3. As alterações mais evidentes foram na espira basal, mas observamos também distorção ciliar com desarranjo no padrão em "v" (ou "W"), com cílios dobrados ou ausência parcial de um dos "braços"do "v" (Figura 4). Em nível das células ciliadas internas também observamos alterações ciliares, com cílios presentes, mas desarranjados.

No grupo tratado previamente com ginkgo biloba (grupo 2), notamos a presença de todas a células ciliadas externas na espira basal sem a distorção dos cílios tanto nas células ciliadas externas quanto nas internas. Nas espiras 2 e 3 ocorreu rara ausência de cílios nas fileiras 1 e 2 das células ciliadas externas, sem distorção ciliar e sem alterações nas células ciliadas internas. (Figura 5).

Selecionamos um quarto grupo com 3 cobaias onde utilizamos somente o extrato de ginkgo biloba na dosagem de 100 mg/Kg/dia por 8 dias, e observamos que as emissões otoacústicas mantiveram-se presentes neste período e a microscopia eletrônica de superfície mostrou a presença de células ciliadas externas em todas as espiras da cóclea.

Quanto à análise estatística dos dados colhidos através do cócleograma da epira basal das cócleas estudadas entre os grupos 2 e 3 não houve diferença estatisticamente significante (t-test: p= 0,591).
Quando os dados de cócleograma dos grupos 1 e 2 e grupos 1 e 3 foram analisados estatisticamente encontramos diferenças significantes estatisticamente (t-test: p < 0,001).





DISCUSSÃO

Sabendo-se que a Cisplatina leva a ototoxicidade por lesão das células ciliadas externas e que as emissões otoacústicas avaliam o estado de contração das células ciliadas externas, sendo este um método simples e representativo do estado funcional destas células, as emissões otoacústicas por produto de distorção foram utilizadas neste estudo.

Até recentemente, a maioria dos trabalhos sobre ototoxicidade pela cisplatina avaliavam as alterações funcionais da cóclea através dos potenciais de ação, somação e microfônico coclear ou através da audiometria de tronco cerebral (BERA). Sokalingam et al. (2000) verificaram que o registro das emissões otoacústicas, transientes e por produto de distorção é um método sensível de avaliação do estado funcional das células ciliadas externas, e que a cobaia albina é o animal mais sensível em termos de ototoxicidade pela cisplatina, sendo que nas doses de 10 a 12 mg/kg/dia, em 3 dias já existe alteração nas emissões otoacústicas por produtos de distorção e lesão das células ciliadas externas, com depressão na amplitude dos produtos de distorção maior do que nas emissões otoacústicas transientes.16,21,23-26,54

Com relação à dose da cisplatina escolhida para o estudo, diversos trabalhos da literatura apontam as dosagens, via de administração e tempo de uso ideais para o estudo dos efeitos de ototoxicidade pela cisplatina. Cardinal et al. (2000) mostram que nas doses de 1,5 a 2,0 mg/Kg /dia de cisplatina intraperitoneal, em cobaias albinas ocorre 60% a 65% de perda celular em 8 dias, evidenciada na espira basal da cóclea.11,17,18,46,51

Nas doses de 8,0 a 15,0 mg/Kg intraperitoneal, dose única, já existem alterações nas emissões otoacústicas por produtos de distorção e na audiometria de tronco cerebral.11,54

Escolhemos a dose de 80 mg/Kg/dia por 8 dias, pois seguramente encontraríamos lesões de mais de 65% das células ciliadas externas na espira basal, com alterações evidentes nas emissões otoacústicas por produto de distorção e à microscopia eletrônica.11

No grupo em estudo onde utilizamos 80 mg/Kg/dia, em 3 a 7 dias notamos alterações com lesão celular às três fileiras de células ciliadas externas e algumas alterações ciliares na fileira de células ciliadas internas.

Com relação aos mecanismos envolvidos na ototoxicidade pela cisplatina, diferentes estudos têm tentado diferenciar tais mecanismos, para se poder atuar com mais precisão e eficácia com o uso de agentes otoprotetores.

Ravi et al. (1995), estudando os efeitos da cisplatina sobre os mecanismos antioxidantes na cóclea através da medida nos níveis de glutation, glutation oxidado e malonil dialdeído, bem como atividade de enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase, catalase, glutation peroxidase e glutation redutase, verificaram que a atividade da superóxido dismutase e catalase e os níveis de malonildialdeído estavam significantemente aumentados, e, as atividades da glutation peroxidase e glutation redutase estavam significativamente reduzidas nas cócleas sob ação da cisplatina.27

Trabalhos recentes mostram que tal mecanismo pode explicar os efeitos ototóxicos da cisplatina.30,31,40,50

Smoorenburg et al. (1999) mostram que as alterações nos sistemas antioxidantes das células ciliadas externas são importantes, e que diferentes agentes otoprotetores testados até o momento atuam prevenindo a interação da platina com a superóxido dismutase, impedem a formação de radicais livres, deslocam a platina do seu sítio tóxico e podem interagir diretamente com a cisplatina, no entanto, estes dois últimos mecanismos podem interferir na potência antineoplásica da cisplatina.32,50

Huang et al. (2000) mostram a lesão coclear com apoptose das células ciliadas externas submetidas a stress oxidativo. A cisplatina leva à formação de espécies de oxigênio reativo e radicais livres intracelulares, que interagem com os fosfolípides de membrana das células ciliadas externas, levando à peroxidação aldeído lipídica (4-hidroxinonenal) que é um conhecido mediador de apoptose para as células ciliadas externas e neurônios auditivos. Assim, propõem que a otoproteção deve atuar nos mecanismos de anti-oxidação, podendo-se atuar em três pontos básicos: 1) prevenção da formação de oxigênio reativo, 2) neutralização de produtos tóxicos da peroxidação lipídica e 3) bloqueio às substâncias que causam dano à membrana das células sensoriais, bloqueando os mediadores de apoptose.33,34

Diferentes substâncias vêm sendo testadas no intuito de otoproteção a cisplatina, como: dietilcarbamato, ácido 4-metiltiobenzóico, ebselen, melatonina, ácido lipóico9,40,42,43,45, acetil cisteína38, fosfomicina47, neurotrofinas39, análogos do ACTH.20,41,44

Muitas destas substâncias têm efeitos colaterais in vivo e não se sabe sobre sua possível atuação bloqueando os efeitos antineoplásicos da cisplatina.

Fukaya et al. (1999) testaram os efeitos do extrato seco de ginkgo biloba (egb 761) sobre a ototoxicidade pela cisplatina como sendo um possível agente otoprotetor. Em tal estudo foram utilizados ratos albinos, a dosagem de cisplatina utilizada foi de 1,5 mg/Kg/dia durante 10 dias, com medidas fisiológicas dos potenciais de ação e estudo histológico. Observaram que a ginkgo biloba protege as células ciliadas externas.46

A Ginkgo biloba apresenta propriedades antioxidantes, atua diminuindo a peroxidação lipídica, aumentando os níveis de catalase, superóxido dismutase e glutation. No plasma, também atua formando complexos com fosfolípides, aumentando sua atividade antioxidante. Em nível intracelular, atua em mitocôndrias, na fosforilação oxidativa do RNA mitocondrial e a nível do Complexo de Golgi, auxiliando no mecanismo de reparo do DNA com melhora do "status antioxidante" celular, com aumento dos níveis de glutation intracelular e diminuição na incorporação de 3H-timidina.56-62

Nossa proposta foi de tentar confirmar tais achados, mas utilizando como animal experimental a cobaia albina, que tem se mostrado muito mais sensível aos efeitos ototóxicos da cisplatina (quando comparado ao rato albino) e utilizar doses elevadas de cisplatina, que são seguramente lesivas para as células ciliadas externas.16,46

Como Fukaya et al., observamos que existe um efeito protetor da ginkgo biloba para as células ciliadas externas, não encontramos alterações às emissões otoacústicas por produtos de distorção após 8 dias de uso da cisplatina (80 mg/ Kg/ dia), quando da associação com a ginkgo biloba, não encontramos lesão celular à células ciliadas externas a microscopia eletrônica de varredura, na espira basal da cóclea; nas espiras 2 e 3 encontramos a ausência de 1 ou 2 células em metade das cócleas analisadas.

Considerando os mecanismos de ototoxicidade pela cisplatina, relacionados aos mecanismos de antioxidação celular e formação de radicais livres, e, sendo que o extrato de ginkgo biloba leva à redução da peroxidação lipídica, com limpeza de superóxidos, impedindo a formação de radicais livres, além de ser um medicamento largamente utilizado em humanos e com efeitos colaterais considerados pouco significativos e as evidências de otoproteção à cisplatina, existe a possibilidade de uso concomitante da ginkgo biloba e cisplatina para tentar-se minimizar os efeitos ototóxicos desta, tanto em adultos quanto em crianças.

CONCLUSÕES

1. O extrato seco de ginkgo biloba (egb 761) tem um efeito protetor para as células ciliada externas, em cócleas de cobaia albina contra a agressão pela cisplatina, provavelmente por seu efeito modulador dos sistemas de defesa anti-oxidantes destas células, impedindo assim a formação de radicais livres celulares ou favorecendo sua eliminação pela célula exposta ao stress oxidativo, conforme acredita-se ser o mecanismo de ação da ginkgo biloba.

2. Por ser uma droga largamente utilizada na prática clínica e por não serem descritos efeitos colaterais importantes, bem como não existirem descrições sobre interações com outras drogas, a Ginkgo Biloba poderá ser estudada em seres humanos como potencial agente otoprotetor aos efeitos de drogas ototóxicas como a Cisplatina.

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1 Médico assistente.
2 Professor Titular.
3 Técnicos de Laboratório.

Área de Otorrinolaringologia do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de
Cabeça e Pescoço da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo.
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo.

Endereço para Correspondência: Prof. Dr. José Antônio A.de Oliveira - Área de Otorrinolaringologia do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo - Campus USP.

Avenida Bandeirantes, 3900 Ribeirão Preto SP 14049-900
Tel (0xx16) 602-2863 - Fax (0xx16) 602-2860

Artigo recebido em 13 de maio de 2003. Artigo aceito em 05 de junho de 2003.