INTRODUÇÃO

Doenças malignas de cabeça e pescoço são responsáveis por 4% de todos os tipos de câncer. Os carcinomas de laringe representam de 25% a 40% dos tumores malignos de cabeça e pescoço¹. O papel de vários fatores, especialmente do tabagismo e do etilismo, foi claramente demonstrado no desenvolvimento do carcinoma de laringe. Sabe-se, ainda, que certos vírus têm potencial oncogênico. Há vários anos, a relação entre carcinoma de laringe e vírus se tornou um popular tópico pesquisa^2-4.

O vírus Epstein-Barr (EBV) está presente em todas as populações e infecta mais de 95% dos seres humanos durante a primeira década de vida⁵. O alcance do gênero dos linfocitovírus, que também inclui o EBV, é geralmente restrito a linfócitos B de primatas, o sítio das infecções in vivo por vírus latente. A infecção de linfócitos B de primatas por linfocitovírus tipicamente resulta em infecção latente caracterizada pela persistência do genoma viral com expressão de produtos genéticos latentes que contribuem com o processo de transformação e proliferação celular⁶. A íntima relação entre infecção por EBV e carcinoma nasofaríngeo é amplamente reconhecida⁷. Carcinomas que compartilham as características fisiológicas dos carcinomas nasofaríngeos indiferenciados foram identificados em outras partes do corpo, incluindo timo, laringe, amígdalas, glândulas salivares, pulmões, pele, colo uterino, bexiga e estômago^2,7-23. Recentemente, estudos descreveram a detecção de EBV por PCR em percentual significativo de tumores de mama e carcinomas hepatocelulares^5,7,8,23. Outros estudos demonstraram um possível papel para o EBV no desenvolvimento de carcinoma espinocelular de laringe⁸.

Objetivo

O DNA do EBV foi investigado com o uso de um método molecular sensível e específico, a reação da cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR), a partir de tecidos tumorais de pacientes com carcinoma de laringe para determinar o papel do EBV na etiologia do carcinoma de laringe. Foi também analisada a relação entre a presença de DNA viral e tabagismo, etilismo, localização (glótica, supraglótica ou subglótica) e diferenciação do tumor (bem, moderado ou pouco diferenciado).


MÉTODO

Foram incluídas no estudo amostras frescas de tecido tumoral retiradas de 25 pacientes aleatoriamente escolhidos, atendidos no Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço entre novembro de 2007 e novembro de 2008 com queixas de rouquidão, dispneia, tosse, garganta inflamada e diagnóstico de carcinoma de laringe com base nos resultados de exame patológico feitos após laringectomia ou biópsia.

O grupo de controle foi composto por amostras frescas de tecido retiradas de pacientes operados por lesões laríngeas benignas como pólipos, nódulos, cistos ou granulomas. Também foram incluídas biópsias de pacientes diagnosticados com câncer de laringe que subsequentemente tiveram desmentida a malignidade de suas lesões por meio de exames de anatomia patológica. Dezessete amostras obtidas de pacientes com lesões benignas formaram o grupo de controle. Biópsias de lesões pré-malignas como leucoplasia ou displasia não foram incluídas no estudo. O presente estudo contou com a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da instituição (protocolo nº 09-230). Todos os pacientes foram informados sobre o estudo no pré-operatório e assinaram termos de consentimento informado.

Todas as amostras foram colhidas na sala de cirurgia a partir de biópsias de tecido fresco pouco antes da fixação do tecido em formalina em procedimento estéril para evitar contaminação.

Os pacientes foram submetidos a meticuloso exame de cabeça e pescoço, incluindo laringoscopia indireta, e foram avaliados para localização do tumor, tabagismo, etilismo, tempo de tabagismo e etilismo e tipo histopatológico do tumor. Os dados sobre tabagismo e etilismo foram colhidos no pré-operatório com a ajuda de um questionário específico que contemplava questões sobre a duração do hábito e quantidades consumidas. Os estudos de imagem necessários foram feitos nos pacientes em que havia suspeita de câncer antes da biópsia por laringoscopia direta.

A presença de DNA de EBV nas amostras de tecido foi investigada por PCR qualitativo com o uso da técnica RT-PCR.

Obtenção do DNA

O DNA de EBV foi obtido a partir das amostras com o QIA Amp DNA Minikit (Qiagen, Alemanha), segundo o procedimento apresentado no manual do kit.

Multiplicação do DNA

O DNA obtido das amostras de tecido foi multiplicado com o equipamento Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Austrália) e o kit Qiagen Artus EBV RT PCR (número de catálogo 4501263) (lote número 130162115) (sensibilidade 3,8 cópias/µl). Em todos os estudos foi usado um controle negativo para evitar risco de contaminação.

Avaliação dos Dados

A análise dos dados foi executada com o software Rotor-Gene 1.7.75. O kit de quantificação de EBV incluía dois corantes fluorescentes, JOE e FAM. Enquanto JOE garante controle interno visível, FAM indica positividade para DNA de EBV. JOE é verificado no canal amarelo com comprimento de onda de 530-555 e FAM é verificado no canal verde com comprimento de onda de 470-510.

Os resultados foram assim interpretados:

1. Canal FAM positivo: positivo para DNA de EBV na amostra. Se a positividade for muito alta, o canal JOE pode ser negativo.

2. Canal FAM negativo e canal JOE positivo: negativo para DNA de EBV na amostra. Se o canal JOE também for negativo, a reação provavelmente sofreu inibição e a análise foi repetida.

Análise Estatística

O teste do Qui-quadrado foi usado para comparar a positividade do PCR para EBV dos grupos de estudo e controle e determinar a associação entre positividade do PCR para EBV e tabagismo, etilismo, localização do tumor (glótica, supraglótica, subglótica) e diferenciação do tecido tumoral (bem, moderadamente, pouco diferenciado). Todos os cálculos estatísticos foram executados com o software SPSS versão 15.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, Illinois) e p < 0,05 foi considerado significativo.


RESULTADOS

Amostras de 25 pacientes do sexo masculino (idades entre 42 e 67 anos, média de 54,6 anos) atendidos na clínica de Otorrinolaringologia e diagnosticados com carcinoma de laringe após biópsia por laringoscopia direta foram incluídas no estudo. As amostras foram colhidas durante laringectomia parcial ou total de 13 pacientes e durante biópsia por laringoscopia de 12 pacientes. O grupo de controle foi composto por amostras de tecido de 17 pacientes (idade média de 48,8 anos, 13 homens (76,5%) e quatro mulheres (23,5%)) atendidos na clínica por rouquidão e diagnosticados com lesões laríngeas benignas (pólipos, granulomas, cistos) por exame laringoscópico e biópsia. Após exame de cabeça e pescoço e laringoscopia direta, os pacientes com carcinoma de laringe foram divididos em três grupos (glótico, supraglótico e subglótico) em função da localização da lesão. Tumores glóticos foram encontrados em 64% (16/25) dos pacientes, enquanto carcinomas de laringe supraglóticos foram detectados em 36% (9/25) dos indivíduos. Nenhuma lesão subglótica foi detectada em nosso grupo de estudo.

As amostras de tecido retiradas dos pacientes foram estudadas por PCR quantitativo com a técnica RT-PCR para a detecção de DNA de EBV. Controle interno foi positivo para todos os pacientes.

PCR positivo para EBV foi identificado em 40% (10/25) dos casos de carcinoma de laringe. A carga viral de EBV foi inferior a 10³ cópias/ml em três pacientes, variou entre 10³ e 10⁵ cópias/ml em seis pacientes e foi superior a 10⁵ cópias/ml em um paciente. O PCR foi positivo em 66,7% (6/9) dos tumores supraglóticos e em 25% (4/16) das lesões glóticas. No grupo de controle, 52,9% (9/17) dos pacientes tiveram PCR negativo para EBV e os restantes 47,1% (8/17) foram positivos para EBV no PCR. Em cinco destes pacientes, a carga viral foi inferior a 10³ cópias/ml; nos três restantes a carga viral ficou entre 10³ e 10⁵ cópias/ml. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de controle e estudo em termos de positividade para EBV no PCR. Não foi identificada correlação direta entre EBV e patogenia de carcinoma espinocelular (CEC) de laringe (p > 0,05) (Tabela 1). Também não houve relação significativa entre positividade para DNA de EBV e localização do tumor (p > 0,05).




A investigação patológica das amostras colhidas dos pacientes revelou que 44% (11/25) dos indivíduos tinha CEC bem diferenciado, 32% (8/25) tinham CEC moderadamente diferenciado, 20% (5/25) tinham CEC pouco diferenciado e 4% (1/25) tinham CEC basaloide. Positividade para DNA de EBV foi identificada em 27,3% (3/11) dos pacientes com CEC bem diferenciado, em 37,5% (3/8) dos indivíduos com CEC moderadamente diferenciado, em 60% (3/5) dos pacientes com CEC pouco diferenciado e em um indivíduo com CEC basaloide (Tabela 1). Não foi encontrada correlação estatisticamente significativa entre positividade para EBV e grau de diferenciação do tumor (p > 0,05).

Pacientes com câncer e componentes do grupo de controle foram entrevistados para identificar presença de tabagismo e consumo de álcool. Noventa e seis porcento (24/25) dos pacientes do grupo com carcinoma de laringe eram tabagistas. O período de tabagismo variou entre 15 e 43 anos (média 30 ± 4,5 anos), com 20 a 40 cigarros por dia (média 24,5 ± 8,25 cigarros). Sessenta porcento (15/25) dos pacientes consumiam álcool regularmente (pelo menos duas vezes por semana) por um período de 10 a 30 anos (média 22,5 anos). No grupo de controle, 76,5% (13/17) dos pacientes eram tabagistas. O período de tabagismo variou entre 14 e 39 anos (média 27,3 ± 3,8 anos), com 20 a 40 cigarros por dia (média 23,5 ± 7,5 cigarros). Destes indivíduos, 17,6% (3/17) consumiam álcool regularmente há uma média de 28,3 anos (20 a 35 anos). A positividade para DNA de EBV foi de 37,5% (9/24) nas amostras de tecido de pacientes tabagistas com câncer. No grupo de controle, positividade para DNA de EBV foi encontrada em 46,2% (6/13) dos tabagistas. No grupo com câncer, as amostras colhidas de pacientes que consumiam álcool revelaram positividade para DNA de EBV em 40% (6/15) dos casos. DNA de EBV não foi encontrado em amostras colhidas de pacientes no grupo de controle que consumiam álcool. Não houve associação estatisticamente significativa entre positividade para DNA de EBV, tabagismo e consumo de álcool (p > 0,05) (Tabela 2).




DISCUSSÃO

O EBV está presente em todas as populações, infectando mais de 95% dos seres humanos durante as primeiras décadas de vida⁷. Nos países em desenvolvimento, certas práticas culturais levam à exposição ao EBV na infância. A infecção primária por EBV em crianças está tipicamente associada a síndromes agudas não diagnosticadas. Em países mais desenvolvidos, contudo, a infecção primária por EBV é frequentemente postergada, vindo a ocorrer na adolescência ou idade adulta, podendo resultar em um distúrbio linfoproliferativo autolimitante chamado mononucleose infecciosa (MI)⁶.

Dados de vários estudos sugerem que o EBV está relacionado ao desenvolvimento ou progressão do carcinoma espinocelular da nasofaringe, cavidade oral, laringe e esôfago, além de estar associado a epitelioma gástrico e linfoma de Hodgkin^8-16,23-25. Além disso, o EBV já foi correlacionado às etiologias de linfoma de Burkitt, carcinoma tímico e síndrome de Sjögren^17,19.

O fator ambiental mais contundente da patogenia do carcinoma de laringe é o tabagismo. Refluxo gastroesofágico, radiação, consumo de frutas ricas em carotenoides e exposição a pó de madeira, metais pesados e pó de carvão são fatores etiológicos suspeitos²⁶. Além disso, já se pensou que fatores virais tivessem papel na etiologia do carcinoma de laringe. Alguns estudos, com diferentes resultados, foram conduzidos sobre o papel de fatores virais, principalmente sobre o efeito do papilomavírus humano (HPV) e do EBV, na etiologia do carcinoma de laringe²⁷. Apesar da presença de vários tipos de HPV nas amostras de pacientes com carcinoma de laringe em alguns estudos, o HPV não foi considerado como tendo forte efeito carcinogênico sobre o desenvolvimento de carcinomas de laringe, já que tais observações foram excepcionais^28,29. Recentemente, foram publicados relatos sobre associação entre EBV e carcinoma de laringe⁸ e artigos refutando tal correlação^19,30.

Gök et al.²⁰ pesquisaram a presença de DNA de EBV por PCR em amostras de tecido fixadas em formalina incluídas em parafina de 22 pacientes com carcinoma espinocelular de laringe e de 17 pacientes com nódulos nas pregas vocais. O PCR identificou DNA de EBV em 11 pacientes (50%) com carcinoma de laringe e em sete pacientes (41,2%) com nódulos nas pregas vocais. Não foi identificada diferença significativa entre os grupos em termos de positividade para DNA de EBV e duração do tabagismo, número de cigarros consumidos por dia, localização da doença e estadiamento do tumor, como também observado em nossos resultados.

Goldenberg et al.²¹ não identificaram relação significativa entre EBV e desenvolvimento do tumor em estudo conduzido com 300 pacientes com câncer de cabeça e pescoço, incluindo tumores de laringe, hipofaringe, orofaringe e cavidade oral²¹. Os autores também não encontraram correlação entre positividade para EBV e exposição ao fumo, consumo de álcool ou grau do tumor. Foram detectadas baixas quantidades de EBV na minoria dos tumores de cabeça e pescoço, associadas à presença de genoma de EBV em raras células linfoides ou epiteliais adjacentes ao tumor primário de cabeça e pescoço.

No estudo de Oliveira et al.², o EBV foi estudado com técnicas de biologia molecular em tecidos de tumor incluídos em parafina retirados de 110 pacientes com CEC de laringe, sem ser detectado em nenhum dos pacientes. Semelhantemente, Atula et al.¹⁹ sugeriram que o EBV não estaria associado ao carcinoma de laringe após a análise para DNA de EBV de 79 amostras congeladas de biópsias de pacientes com câncer de cabeça e pescoço por hibridização Southern blot e PCR.

Em seu estudo, Vlachtsis et al.²² demonstraram positividade para DNA de EBV em 39 (43,3%) de 90 pacientes com CEC de laringe e positividade para HPV e EBV em 19 (21,1%) destes indivíduos. Foi impossível determinar o efeito do EBV sobre o carcinoma de laringe e seus resultados, já que os autores não dispunham de um grupo de controle, mas a taxa relatada de positividade para DNA de EBV em CEC de laringe foi semelhante à que encontramos no presente estudo.

Kiaris et al.⁸ também estudaram a incidência de EBV em CEC de laringe. Os autores analisaram a presença de DNA de EBV por PCR sensível e utilizaram RFLP (polimorfismo no comprimento dos fragmentos de restrição) para confirmar a especificidade da reação de amplificação do PCR. Nove dos 27 tecidos tumorais foram positivos para DNA de EBV e apenas quatro (15%) peças de tecido normal adjacente exibiram evidências de infecção por EBV. Três amostras foram positivas para EBV tanto em tecidos normais como tumorais. Os pesquisadores encontraram uma incidência relativamente elevada de EBV em tecidos tumorais (33%) de pacientes com câncer de laringe, comparada à baixa incidência (15%) de detecção do genoma do vírus em tecido normal adjacente, o que indica um provável papel do EBV no desenvolvimento da doença. Contudo, não houve associação entre positividade para EBV e estadiamento da doença ou diferenciação patológica.

Nosso estudo não identificou relação significativa entre os grupos de controle e estudo em termos de positividade para EBV no PCR e carga viral de EBV. Da mesma forma, não houve associação direta entre EBV e patogenia do carcinoma espinocelular de laringe. A maioria dos estudos conduzidos anteriormente corroboram nossos resultados, mas alguns artigos relatam associação entre EBV e CEC de laringe. Acreditamos que tal contradição se deva a tamanhos reduzidos de amostra e variedade da sensibilidade e especificidade dos métodos usados para determinação de EBV.

Também não identificamos associação significativa entre positividade para EBV e localização ou diferenciação do tumor (p > 0,05). Além disso, dado que tabagismo e consumo de álcool são fatores de risco bem estabelecidos para o desenvolvimento de carcinoma de laringe, investigamos a associação entre positividade para EBV e esses fatores sem conseguirmos demonstrar relações entre os mesmos e positividade para EBV ou carga viral (p > 0,05). Estes resultados sugerem que o EBV não apresenta sinergia com o desenvolvimento de carcinomas de laringe com fatores de irritação como tabagismo e álcool.

A principal vantagem de nosso estudo foi o uso de amostras frescas de tecido para a determinação do DNA de EBV. A maioria dos estudos anteriores sobre a presença de EBV foram baseados em amostras fixadas em formalina incluídas em parafina, apesar de formalina ser um conhecido inibidor de PCR³¹. Assim, alguns resultados falsos negativos podem ter sido obtidos nos estudos anteriores.

No presente estudo, as peças cirúrgicas de pacientes com lesões laríngeas benignas foram aceitas como controles, já que não seria razoável retirar amostras de tecido de voluntários saudáveis. Curiosamente, o DNA de EBV foi encontrado em 47,1% dos indivíduos deste grupo, percentual mais elevado que o do grupo de estudo. Portanto, sugere-se que o EBV seja um vírus muito comum que pode permanecer latente nas células da mucosa das vias respiratórias superiores de uma proporção considerável da população.


CONCLUSÃO

O recente estabelecimento da associação entre EBV e carcinoma nasofaríngeo não diferenciado em especial levou à consideração de que talvez também haja relação entre carcinoma de laringe e EBV. Mas os nossos resultados e os relatos da maioria dos estudos anteriores indicam que o EBV é um vírus bastante comum, que pode ser encontrado nas células da mucosa das vias aéreas superiores de uma proporção considerável da população. Ainda que o EBV esteja presente em tecidos tumorais de alguns dos carcinomas espinocelulares de laringe, sua presença não surte efeito sobre a patogenia dos carcinomas de laringe. Mais estudos multicêntricos com amostras maiores precisam ser conduzidos para demonstrar com maior clareza a relação entre EBV e carcinoma espinocelular de laringe. Desta forma, a partir das possíveis associações identificadas, passos positivos poderão ser tomados rumo à prevenção e manejo dos carcinomas de laringe.


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1. Microbiólogo.
2. Professor (Chefe, Departamento de Microbiologia, Faculdade de Medicina da Universidade Gazi, Ankara, Turquia).
3. Especialista (Otorrinolaringologista).
4. Professor (Departamento de Otorrinolaringologia, Faculdade de Medicina da Universidade Gazi, Ankara, Turquia).
5. Professor Associado (Departamento de Microbiologia, Faculdade de Medicina da Universidade Gazi, Ankara, Turquia).

Endereço para correspondência:
Togay Muderris
Ataturk Education and Research Hospital, Department of Otolaryngology
06800 Bilkent, Ankara. Turquia
Tel: 00905323076476
E-mail: togaymuderris@yahoo.com

Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) do BJORL em 21 de outubro de 2012. cod. 10534.
Artigo aceito em 27 de março de 2013.