INTRODUÇÃODesde os primeiros estudos histológicos1 da prega vocal (PV), que demonstraram a íntima relação entre a fisiologia da produção do som e a estrutura da lâmina própria (LP) das pregas vocais, essa região tem despertado a atenção dos laringologistas em todo mundo.
A PV possui uma LP rica em glicosaminoglicanos (GAG), que são as proteínas intersticiais responsáveis pelo preenchimento e pela viscosidade dos tecidos.
O ácido hialurônico (AH), um dos principais GAG da LP, possui alta densidade de cargas negativas em sua estrutura. Isso o torna altamente hidrofílico, fazendo-o ser o grande responsável pela viscosidade, fluidez e preenchimento tecidual2-4.
Vários tipos de distúrbios podem alterar a quantidade de AH das PV e comprometer a qualidade da fonação, sendo o envelhecimento um dos mais prevalentes. Características glóticas indicativas de presbilaringe, como PV arqueada e proeminência dos processos vocais, têm sido descritas por vários autores5-7 e sugerem redução da turgência da LP, com possível redução da concentração de AH.
Outros autores descreveram os efeitos do envelhecimento sobre proteínas fibrosas, mostrando atrofia das fibras elásticas e aumento da densidade das fibras de colágeno da LP8,9.
Apesar de também ter sido demonstrada uma diminuição na expressão de genes que codificam a AH sintase nas pregas vocais de ratos idosos10, as tentativas de quantificar as diferenças na quantidade de AH relacionadas com o envelhecimento não foram bem sucedidas e requerem estudos metodologicamente mais específicos11,12. MÉTODOs de coloração de tecidos que simultaneamente identificam vários tipos de GAGs são, muitas vezes, erroneamente utilizados para avaliar a quantidade de AH.
O objetivo deste estudo é comparar a concentração de ácido hialurônico em PV de ratos do gênero feminino jovens e idosas.
MATERIAIS E MÉTODOSO projeto de pesquisa foi analisado e aprovado pelo Comitê de ética em Pesquisa, tendo sido realizado estudo experimental.
Usamos as PV de 13 ratas Wistar-sp fêmeas, com cerca de 250 gramas. Foram considerados ratos idosos aqueles com idade próxima aos 24 meses.
Incluímos oito ratas do gênero feminino jovens e cinco ratas do gênero feminino idosas, não gestantes e não puérperas, sem uso prévio de qualquer tipo de medicamento e com alimentação
ad libitum. A laringe foi removida cerca de 2 minutos após o sacrifício e foi conservada em microtubos tipo eppendorf com acetona.
Preparação de amostrasAs duas pregas vocais de cada rata fêmea foram retiradas da laringe e fragmentadas em pequenas partículas. O tecido foi pesado após a centrifugação e secagem, tendo sido, então, submetido à digestão das proteínas com o uso de protease (maxatase alcalino protease; Biocon do Brasil Industrial, Rio de Janeiro, Brasil). Após a inativação da protease por meio de fervura, as amostras foram centrifugadas e a camada flutuante foi coletada para a quantificação do AH.
Quantificação AHPara a determinação do AH, realizamos MÉTODO fluorimétrico utilizando a proteína de ligação ao ácido hialurônico (PLAH)13. A PLAH é isolada da cartilagem bovina e compreende a região globular de um proteoglicano denominado agrecan. No nosso estudo, ela foi usada imobilizada em placas de
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), semelhante a um anticorpo de ligação, e também como uma sonda conjugada à biotina, funcionando como um anticorpo secundário marcado.
As placas de ELISA foram revestidas com PLAH e incubadas com amostras contendo soluções-padrão de ácido hialurônico (000-500 mg/l), para servir como curva padrão da fluorescência, e com a solução amostra obtida a partir do PV, em triplicado.
Posteriormente, as placas de ELISA foram lavadas e a PLAH conjugada à biotina foi adicionada. Após novo processo de lavagem, adicionou-se estreptavidina marcada com európio. Após a liberação do európio da estreptavidina com o uso da solução de
enhancement, a fluorescência final foi medida em um fluorímetro.
Os dados foram interpretados e analisados por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney.
RESULTADOSA Tabela 1 mostra a idade média dos ratos de acordo com os grupos de comparação, seguido pelo desvio padrão de cada grupo. Pode-se notar a grande diferença de idade entre o grupo de ratas fêmeas idosas e jovens.
O grupo de jovens tem idade média de 135,5 dias e é formado por adultos sexualmente maduros. Por outro lado, o grupo de ratas idosas possui média de idade de quase dois anos.
A Tabela 2 mostra a concentração de AH de cada amostra de acordo com os grupos.
Para comparar os grupos, foi aplicado o teste não paramétrico Mann-Whitney (Tabela 3). Podemos, então, observar uma diferença significativa na concentração de AH entre os grupos de ratas idosas e jovens. As ratas idosas têm menor concentração de AH na PV.
DISCUSSÃOUm dos primeiros estudos para detectar GAGs na LP utilizou imunohistoquímica para identificar o receptor de AH, uma vez que os anticorpos não são capazes de se ligar diretamente ao AH2.
Outros autores11 estudaram o ácido hialurônico com a coloração de Ferro Colloidal de Muller-Mowry, que identifica mucopolissacarídeos ácidos e, portanto, cora vários tipos de GAGs. A quantificação ocorreu por comparação colorimétrica de lâminas antes e após o tratamento com hialuronidase testicular, que digere ácido hialurônico, mas também digere o GAG sulfato de condroitina. Usando uma amostra de 10 homens e oito mulheres e com um MÉTODO inespecífico de identificação e quantificação de AH, este estudo foi o primeiro a fazer comparações com relação ao gênero, mostrando maior concentração de AH em homens.
Também usando coloração de Ferro Colloidal de Muller-Mowry, outros autores12 observaram a presença de AH na LP de PV humanas e fizeram comparações entre sexo e idade. Eles utilizaram nove laringes masculinas adultas (de 34 a 52 anos), sete laringes femininas adultas (de 21 a 41 anos), quatro laringes masculinas idosas (de 65 a 77 anos) e cinco laringes femininas idosas (de 65 a 82 anos). Os autores concluíram que, em relação ao gênero, as mulheres tinham menos AH na camada superficial da LP. Todavia, nas regiões mais profundas, a quantidade de AH ultrapassou a dos homens. Quanto à idade, a diferença colorimétrica não foi significativa.
Outro método de coloração tecidual inespecífico que cora simultaneamente vários tipos de GAGs é o Alcian Blue. Alguns autores têm utilizado este MÉTODO de coloração, sem digestão por hialuronidase, para a identificação de mudanças do AH na LP relacionadas à idade14. Esses autores utilizaram oito ratos jovens e oito ratos idosos e encontraram valores mais baixos no grupo de idosos.
Diferentemente dos estudos anteriores, nosso estudo utilizou um MÉTODO de quantificação específico para o AH, o qual fornece sua concentração em nanogramas por miligrama de peso seco13.
Outros autores também utilizaram esse mesmo MÉTODO de fluorescência para a quantificação de AH na prega vocal humana15. No entanto, eles não estudaram possíveis diferenças na concentração de AH em relação à idade.
Nosso estudo utilizou pregas vocais de ratos e, devido ao pequeno tamanho da PV do rato e pela impossibilidade de separar a lâmina própria da musculatura subjacente, toda a profundidade da prega vocal foi quantificada. Portanto, nossos resultados refletem a concentração de AH na lâmina própria e no músculo tireoaritenoideo juntos.
A maioria dos estudos que usam PV humana como material remove a laringe várias horas após a morte, mas, em nosso estudo, o tempo médio decorrido entre a morte e a fixação do tecido foi de 2 minutos. Considerando que os GAGs são substâncias que se degradam rapidamente, a rápida fixação das PV contribuiu para aumentar a exatidão dos nossos resultados.
A manipulação da via aérea antes da morte e o tempo decorrido entre a morte e a fixação da prega vocal são fatores que têm um alto potencial para causar viés. A possibilidade de evitar esses erros reforça as vantagens já descritas do uso de camundongos como modelo animal para estudar as pregas vocais16. Além disso, a capacidade de comparar linhagens genéticas controladas com menor variabilidade entre os indivíduos faz com que os grupos de comparação sejam mais homogêneos e os resultados mais confiáveis.
Ratos idosos são muito difíceis de se obter, devido à sua alta mortalidade. Alguns autores têm demonstrado que a espé cie de ratos Wistar possui longevidade máxima de 34 meses e atinge a sua senescência por volta de 24 meses de idade, momento em que a taxa de mortalidade é de 50%17,18. Essa dificuldade na obtenção de amostras de ratos idosos foi a razão por não termos ratos machos em nosso estudo.
Sabe-se que o conhecimento profundo da LP da prega vocal requer uma compreensão das diferentes funções de cada uma das substâncias envolvidas no mecanismo de vibração da PV. Assim, o ácido hialurônico, como um dos principais componentes da matriz extracelular, é de fundamental importância para a flacidez da onda mucosa da prega vocal e para uma ótima qualidade vocal.
Por isso, acreditamos que este estudo possa contribuir com informações importantes. Com um MÉTODO preciso, que nos fornece a concentração tecidual de AH em relação ao peso seco, nosso estudo demonstrou que o envelhecimento reduz a quantidade de AH na PV de ratas.
CONCLUSÃOOs resultados nos permitem concluir que a prega vocal de ratas fêmeas idosas possui menor concentração de ácido hialurônico que a concentração da prega vocal de ratas fêmeas jovens.
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1. Doutor pela Universidade Federal de São Paulo (Médico do Hospital São Paulo).
2. Doutor pela Universidade Federal de São Paulo (Médico do Hospital São Paulo, Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Universidade Federal de São Paulo).
3. Doutor (Professor e Pesquisador Associado do Departamento de Bioquímica, da Divisão de Biologia Molecular e Departamento de Medicina, Disciplina de Endocrinologia da Universidade Federal de São Paulo).
4. Pós-Doutorado (Professora Titular do Departamento de Bioquímica, da Divisão de Biologia Molecular, Universidade Federal de São Paulo).
5. Livre Docente (Professor Titular do Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço e Diretor do Campus São Paulo - Vila Clementino da Universidade Federal de São Paulo).
Endereço para correspondência:
Dr. Hugo Valter Lisboa Ramos
Rua Napoleão de Barros, 715, sala 17. Vila Clementino
São Paulo - SP. CEP: 04024002
Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da BJORL em 6 de maio de 2011. cod. 7761
Artigo aceito em 1 de fevereiro de 2012.
