INTRODUÇÃO

Carcinomas de cabeça e pescoço representam um grupo de tumores malignos originários do trato aerodigestivo superior, incluindo a cavidade oral, faringe e laringe. Mais de 90% dos carcinomas de cabeça e pescoço são carcinomas espinocelulares e originam dos tecidos epiteliais dessas regiões1.

A incidência de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP) exibe ampla variação geográfica, com 500.000 novos casos em todo o mundo, sendo mais freqüente em países em desenvolvimento. O tabagismo e a ingestão de bebida alcoólica são reconhecidos como os mais comuns carcinógenos para CECP. Entretanto, fatores ambientais podem ser amplamente influenciados pela carga genética do paciente1,2.

O gene supressor tumoral p53 é um fator de transcrição de ligação específico de uma seqüência de DNA que age como principal controle celular de crescimento e divisão. Células normais expressam baixa concentração dessa proteína nuclear em forma inativa; entretanto, em resposta a uma ampla variedade de estresse celular, tais como danos ao DNA, hipóxia ou depleção de grupos de ribonucloesídeos-trisfosfato o p53 é ativado e expressado em excesso. Após ativação, o p53 media ou 1) interrupção do ciclo celular para permitir o reparo do DNA, ou 2) apoptose para remover células com danos irreparáveis3. O Gene p53, localizado na banda cromossômica 17p13.1, é susceptível à mutação somática que estimase ocorrer em 50% de todos os cânceres em humanos3. A maioria dessas mutações causa dramáticos defeitos funcionais no p53. Contrastando a isso, espera-se que apenas uma pequena fração de polimorfismos hereditários causem distúrbios detectáveis à função do p533,4. O polimorfismo no exon 4 do Códon 72 é o polimorfismo de p53 mais comumente estudado, é aquele que codifica ou arginina (Arg) ou prolina (Pro). Especula-se que essas variações alteram a estrutura e a função da proteína p53. Por exemplo, o alelo Pro induz apoptose com cinética mais lenta e reprime transformações menos eficientes quando comparado ao alelo Arg5.

Tentativas de definir as associações do polimorfismo do códon 72 do p53 com a susceptibilidade ou progressão do câncer têm levado a resultados inconsistentes em diferentes etnias e diferentes tipos de câncer, incluindo CECP6-11. Já que não há dados para pacientes iranianos com CECP, investigamos a associação entre a susceptibilidade CECP e o polimorfismo no códon 72 do p53 em um estudo caso-controle. Além disso, avaliamos a associação entre esse polimorfismo e gênero, localização do tumor, idade e estágio da doença quando do diagnóstico.


PACIENTES E MÉTODOS

Pacientes

Todos os participantes foram informados que amostras de sangue seriam usadas para genotipagem, e consentiram em participar do estudo. O Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Shiraz aprovou esse estudo. A Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Shiraz é uma instituição terciária financeiramente mantida pelo Ministério da Saúde e Educação Médica do Iran.

Recrutamos um total de 132 pacientes com CECP (97 homens e 35 mulheres; idade média de 56,6±14,1 anos) no Hospital Universitário (Hospital Khalili) da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Shiraz, Iran. O diagnóstico de CEC foi confirmado para todos os pacientes pela histopatologia. Obtivemos as características dos pacientes, incluindo gênero, localização tumoral, idade ao diagnóstico, metástases e estadiamento clínico TNM a partir de seus registros médicos. O tumor estava localizado na cavidade oral em 52 casos (39,4%), na faringe em 15 casos (11,4%) e na laringe em 65 casos (49,2%). A idade média de início da doença foi 55,9±13,1 anos, variando entre 19 e 83 anos. O estágio da doença foi determinado de acordo com a classificação TNM. O grupo-controle envolveu 123 voluntários saudáveis (93 homens e 30 mulheres; idade média 58,7±12,4 anos), que residiam na mesma região dos pacientes. Os indivíduos do grupo controle não tinham qualquer tipo de câncer ou parente de primeiro grau com história de câncer. Todos os participantes falavam persa como língua nativa.

Preparação do DNA e Reação em Cadeia da Polimerase

Amostras sanguíneas foram coletadas em tubos contendo EDTA e o DNA genômico foi extraído de leucócitos através do método de salting out12. Brevemente, as células sanguíneas foram primeiro tratadas com uma solução de lise de hemáceas (155mM NH4CL e 10mM NaHCO3) e separadas dos leucócitos por centrifugação. Posteriormente, os leucócitos foram lisados em uma solução tampão de lise nuclear (10mM Tris-HCl, 400mM NaCl e 2mM Na2EDTA, pH 8,2). O lisado celular foi digerido à noite a 37ºC por 10% SDS e uma solução de proteinase K (1mg proteinase K em 1% SDS e 2mM Na2EDTA). NaCl saturado (aproximadamente 6M) foi então acrescentado aos tubos que foram agitados vigorosamente, seguido de centrifugação. A proteína precipitada foi deixada, e o sobrenadante contendo o DNA foi transferido para outro tubo e misturado a etanol. Esses tubos foram invertidos várias vezes até o DNA precipitar. As fitas de DNA precipitado foram transferidas para uma micro-centrífuga de 1,5ml contendo tampão TE (10mM Tris-HCl, 0,2mM Na2EDTA, pH 7,5). O DNA ficou 2 horas dissolvendo a 37ºC antes da quantificação.

Amplificamos o DNA através do método de reação em cadeia da polimerase alelo-específico, como previamente descrito13. Usamos dois conjuntos de primers paradetectar os alelos Pro e Arg. As seqüências de nucleotídeos para os primers específicos para p53-Arg foram 5'- TCC CCC TTG CCG TCC CAA-3' (primer dianteiro) e 5'-CTG GTG CAG GGG CCA CGC-3' (primer reverso). As seqüências de primers para amplificação do alelo Pro foram 5'-GCC AGA GGT TGC TCC CCC-3' (primer dianteiro), e 5'-CGT GCA AGT CAC AGA CTT-3' (primer reverso).

Cada amostra foi amplificada por cada conjunto de primers em tubos separados contendo 0,3mmol/L dNTPs, 1,5mmol/L MgCl2, 2U Taq polimerase, e 1x tampão (20mmol/L Tris-HCl, pH 8,4, e 50mmol/L KCl) (volume total de 25µL). A amplificação foi feita em 35 ciclos, através de um programa de touch-down: desnaturação a 94ºC durante 30 segundos, recozimento a 68-62ºC por 10 ciclos e 62-58ºC para os 25 ciclos remanescentes, com extensão a 72ºC por 30 segundos em cada ciclo. Os produtos da PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2% (invitrogen, UK) e corados com brometo de etídio. O produto da PCR foi 177 bp para o alelo Pro e 141 bp para o alelo Arg.

Análise estatística

As freqüências genotípicas foram testadas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Adaptação ao equilíbrio foi verificada através do teste qui-quadrado. Os dados foram analisados através do software SPSS (versão 11.5.0; SPSS, Chicago, IL, EUA). As diferenças na idade média dos pacientes com diferentes genótipos no códon 72 do p53 foram calculadas através da análise de variância de uma via (ANOVA). Outras análises foram feitas através do teste de qui-quadrado. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a um valor de P menor do que 0,05. O odds ratio (OR) e o intervalo de confiança (IC) de 95% foram calculados através do método de Mantel- Haenszel para estimar o risco relativo associado aos alelos.


RESULTADOS

As freqüências de genótipos não diferiram significativamente daquelas esperadas, de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg em pacientes ou indivíduos do grupo controle. As freqüências dos genótipos Arg/Arg, Arg/Pro, e Pro/Pro foram: 37,1%, 47,7%, e 15,2% em pacientes com CECP; e 35,8%, 51,2%, e 13,0% em controles, respectivamente (Tabela 1). A freqüência do alelo Arg foi de 61,0%, e 61,4% em pacientes e controles, respectivamente. A freqüência do alelo Pro foi de 39,0% em pacientes e 38,6% em controles. Não houve diferença estatisticamente significativa na freqüência genotípica entre o grupo de pacientes e o grupo controle (p=0,82). As freqüências de alelos não foram significativamente diferentes entre os dois grupos (p=0,92).




As associações entre genótipos do códon 72 do p53 e gênero, idade ao diagnóstico, localização do tumor, metástases e estadiamento clínico TNM estão resumidosna Tabela 2. A única associação significativa com a distribuição de diferentes genótipos foi encontrada para estadiamento tumoral (p=0,03). O genótipo Pro/Pro foi mais frequentemente encontrado em pacientes no estágio IV do que naqueles com doença no estágio (I-III) (p=0,032). Apesar da freqüência desse genótipo estar aumentadaem pacientes com metástases, o aumento não alcançou significado estatístico (p=0,07).




Como mostrado na Tabela 3, as freqüências dos alelos Pro e Arg foram 28(53,8%) e 24(46,2) nos pacientes do estágio IV, e 55(34,0%) e 107(66,9) em pacientes com doença no estágio I-III; essa diferença foi também significativa (p=0,01), e portadores do alelo Pro tiveram risco 2,2 vezes maior de serem diagnosticados com estágio IV (95% IC=1,2-4,2).




DISCUSSÃO

O gene supressor tumoral p53 participa do reparo do DNA, do ciclo celular, da transcrição gênica e da apoptose3,4; assim, ele representa um importante fator na tentativa de explicar a susceptibilidade ao CECP e variações inter-individuais no tocante a prognóstico. O polimorfismo no códon 72 Arg/Pro do p53 é um polimorfismo funcional cuja distribuição genotípica é significativamente diferente entre diferentes grupos étnicos. Já foi demonstrado que a freqüência do alelo Pro varia de 17% em Saamis Suecos a 63% em Negros Africanos (Nigerianos), e a proporção dos portadores do alelo Arg é mais alta em populações que vivem mais longe do equador da Terra14. A associação desse polimorfismo com câncer, incluindo o CECP em diferentes etnias é ainda muito controversa6-11. Por exemplo, o polimorfismo do códon 72 do gene p53 esteve significativamente associado ao CECP em populações Italianas8, mas não em populações Indianas9. A alta variabilidade do polimorfismo Arg/Pro do códon 72 do p53 entre populações tem sido mencionado para explicar diferenças observadas no códon 72 em pessoas com câncer de diferentes etnias7. Parece que a correlação entre o códon 72 e o câncer deveria ser determinada em cada população.

Comparamos as freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo Arg/Pro do códon 72 do p53 em pacientes com CECP e indivíduos saudáveis em uma população do Irã meridional. Pelo nosso conhecimento, essa é a primeira tentativa de identificar associações entre esse polimorfismo e características clínicas e prognósticas na população iraniana. Não encontramos diferenças significativas em genótipo ou freqüência alélica entre os pacientes e os controles saudáveis. Entretanto, o genótipo Pro/Pro e o alelo Pro, associados à cinética mais lenta da apoptose e supressão menos eficiente da transformação do que oalelo Arg5, estavam significativamente aumentados em pacientes com doença mais avançada. Segundo nossos resultados, poder-se-ia argumentar que o efeito do alelo Pro pode ser mais pronunciado na progressão do câncer do que na formação deste. Apesar dos alelos Pro e Arg terem algumas diferenças em suas capacidades de induzir apoptose e supressão de transformação, eles não diferem em atividades de ligação específica de seqüência de DNA5. Curiosamente, mutações no p53 encontradas em 50-55% de todos os cânceres em humanos com importante papel na formação do câncer selecionam fortemente para proteínas p53 com defeitos para se ligar ao DNA3. Concordando com nossos resultados, Tu et al. em uma população tailandesa não encontraram associação entre polimorfismo no códon 72 do p53 e susceptibilidade ao carcinoma espinocelular oral, mas descobriu que o polimorfismo no códon 72 do p53 estava associado ao estágio da doença, e à sobrevida geral e livre de doença de pacientes irradiados10.

Em nossa população estudada, a distribuição do polimorfismo no códon 72 do p53 não diferiu significativamente entre os pacientes segundo gênero, idade ao diagnóstico ou localização tumoral. As relatadas associações de características do CECP com esse polimorfismo também variam largamente na literatura10,11. Por exemplo, enquanto o alelo Pro esteve associado à idade precoce de início do CECP em pacientes caucasianos não-hispânicos11, nenhuma associação foi encontrada entre esse polimorfismo e a idade de início da doença em pacientes tailandeses10. A via do p53 é composta de muitos genes e uma ampla variedade de sinais de estresse celular que ativam o p53 podem resultar na transcrição de distintos genes3. Diferenças em genes p53 que interagem, e também diferenças em sinais de estresse entre várias populações podem representar outras explicações para os diferentes resultados.


CONCLUSÃO

Em conclusão, detectamos uma significativa associação positiva entre o alelo Pro do códon 72 do p53 e o estágio tumoral, um importante fator prognóstico para CECP. Entretanto, não encontramos associação significativa entre esse polimorfismo e o risco de desenvolvimento de CECP em pacientes iranianos. Precisamos de mais dados de um número maior de pacientes para determinar a possível associação entre o polimorfismo Arg/Pro no códon 72 do p53 e o risco de CECP.


AGRADECIMENTOS

Esse estudo foi financiado por verbas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Shiraz (Verba num. 83-2102) e do Instituto de Pesquisa de Câncer de Shiraz (Verba num. ICR-82-93). Agradecemos K. Shashok (Autor AID no Leste do Mediterrâneo) pela ajuda na melhoria do manuscrito em inglês.


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1. Dr. (Professor Assistente - Instituto Shiraz de Pesquisa do Câncer - Universidade de Ciências Médicas de Shiraz, Shiraz, Iran.)
2. Dr. (Professor Assistente, Departamento de Cirurgia de Ouvidos, Nariz e Garganta - Hospital Khalili, Universidade de Ciências Médicas de Shiraz, Shiraz, Iran.)
3. Professor. (Professor, Departamento de Cirurgia de Ouvidos, Nariz e Garganta - Hospital Khalili, Universidade de Ciências Médicas de Shiraz, Shiraz, Iran.)
4. Dr. (PhD, Departamento de Cirurgia de Ouvidos, Nariz e Garganta - Hospital Khalili, Universidade de Ciências Médicas de Shiraz, Shiraz, Iran.)
5. Mestrado - (MSc, Instituto Shiraz de Pesquisa do Câncer - Universidade de Ciências Médicas de Shiraz, Shiraz, Iran.)
6. Mestrado (MSc, Instituto Shiraz de Pesquisa do Câncer - Universidade de Ciências Médicas de Shiraz, Shiraz, Iran.)
7. Professor. (Diretor do Instituto Shiraz de Pesquisa do Câncer - Universidade de Ciências Médicas de Shiraz, Shiraz, Iran.)

Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da BJORL em 17 de abril de 2009. cod. 6357
Artigo aceito em 24 de agosto de 2009