INTRODUÇÃOA Estomatite Aftoide Recorrente (EAR) é uma doença comum que provoca o aparecimento de aftas de repetição na mucosa bucal. Sua incidência oscila em torno de 20% da população mundial. É mais frequente em pacientes do sexo feminino. Apesar da incidência elevada, e vários estudos dedicados ao esclarecimento de suas causas, desperta enormes controvérsias quanto à sua etiologia1.
Atualmente, define-se EAR como doença caracterizada pelo aparecimento de aftas em mucosa oral, de forma recorrente (quinzenal ou mensalmente), por um período mínimo de um ano, tendo seu início usualmente na infância ou adolescência2, sem evidência de doença sistêmica associada. No entanto, alguns autores afirmam que a incidência da EAR é preponderante na segunda década de vida3,4.
A doença usualmente apresenta três formas clínicas, baseadas no aspecto e tamanho das ulcerações: minor, major e herpetiforme. A Estomatite Aftoide Recorrente Minor (EARi) afeta 80% dos pacientes com EAR, e é caracterizada por úlcera rasa, dolorosa, oval ou arredondada, de diâmetro menor que 5mm. Acomete a mucosa oral não-queratinizada, especialmente vestíbulo, mucosa labial e bucal, palato mole, língua e assoalho de língua. A cicatrização das lesões ocorre em um período de 7 a 10 dias. A Estomatite Aftoide Recorrente Major (EARj) é a forma mais severa. O diâmetro das aftas chega a ultrapassar 1cm, persistindo na cavidade oral por um período superior a duas semanas, muitas vezes deixando cicatriz. A terceira forma e menos comum é a Estomatite Aftoide Recorrente Herpetiforme (EARh) caracterizada por múltiplas úlceras, pequenas, de 1 a 3mm de diâmetro, e dolorosas, que podem se coalescer, formando lesões maiores e irregulares5.
Na gênese da EAR, a história familiar parece ser importante, e relatos de casos na mesma família são encontrados em 24% a 46% dos casos6,7. Além disso, pacientes com história familiar de EAR podem desenvolver úlceras orais mais precocemente e apresentam quadro mais severo que aqueles sem antecedentes familiares8. Gêmeos monozigotos têm maior probabilidade de sofrerem da doença que gêmeos dizigotos9.
Uma variedade de associação ou não-associação de antígenos HLA e EAR tem sido relatada na literatura médica. A associação da doença com HLA-B12 foi descrita por Lehner et al.10 e Malmström et al.11, porém não confirmada por outros autores12,13. Em grupos de pacientes de diferentes origens étnicas, uma significante associação entre HLA-DR2 e EAR foi observada10,14.
A fisiopatologia da EAR parece estar ligada a uma desordem na imunomodulação15. Os linfócitos parecem ser as células predominantes nas lesões aftoides, ocorrendo uma variação na proporção CD4+ / CD8+ durante seus diferentes estágios - prodrômico ou pré-ulcerativo, ulcerativo e de cicatrização16,17,18.
O principal papel do complexo principal de histocompatibilidade em humanos chamado de Sistema HLA é apresentar peptídeos processados para que sejam reconhecidos pelo receptor da célula T nas diferentes funções imunológicas. Como este reconhecimento se faz ao mesmo tempo envolvendo o peptídeo e a molécula HLA, pequenas variações em um destes dois componentes levam ao reconhecimento imunológico e ao desencadeamento de ativação celular e resposta específica19. Entende-se assim porque as moléculas HLA estão diretamente implicadas no controle genético da resposta imune.
No Brasil, não temos conhecimento de nenhum estudo que relacione a tipificação HLA com EAR. Frente a isto, o objeto do nosso trabalho foi tipificar moléculas HLA classe I e classe II de pacientes brasileiros portadores de EAR e comparar com grupo controle composto de 964 brasileiros saudáveis.
MATERIAL E MÉTODO
MaterialEste trabalho possui um desenho prospectivo, transverso e investigativo desenvolvido no período de fevereiro de 2004 a maio de 2006. Foi aprovado no comitê de ética e pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo sob o nº 876/04.
Grupo De EstudoO grupo de estudo foi composto inicialmente por 58 pacientes com hipótese diagnóstica de EAR admitidos no Ambulatório de Estomatologia da Divisão de Clínica Otorrinolaringológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Grupo ControleO grupo controle foi composto por uma seleção de 4172 voluntários brasileiros saudáveis membros do banco de dados de doadores de medula da Central de Transplante do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Destes foram selecionados apenas um membro de cada família, para evitar a presença de haplótipos, totalizando no final 962 indivíduos brasileiros.
MétodoOs pacientes foram submetidos a anamnese, exame físico geral, exame otorrinolaringológico completo, a um protocolo prévio de exames laboratoriais, além de biópsia da lesão e da área mucosa adjacente.
O protocolo prévio de exames séricos constou de glicemia de jejum, eletroforese de proteínas, hemograma completo, coagulograma (TP + TT + TTPA), anti-HIV 1 e 2, dosagem de complemento total e frações, fator reumatoide, fatores antinúcleo, dosagem sérica de IgA, IgG, IgM, VHS, proteína C reativa e sorologia para sífilis.
Para afastar a etiologia das úlceras relacionadas a outras doenças, tais como lesões penfigóides, Doença de Behcet, Doença de Crohn ou vasculites de outra natureza todos os pacientes foram submetidos à biópsia das lesões para posterior exame histopatológico e de imunofluorescência direta.
A biópsia foi realizada sob anestesia infiltrativa com xilocaína 2% sem vasoconstritor, com a utilização de um Punch de tamanho compatível com a lesão (4-5mm). Foi retirada uma amostra contendo área lesionada e outra de área adjacente sã, sendo a primeira acondicionada num frasco contendo solução de formol a 10% e encaminhada a exame histopatológico. A segunda peça foi colocada sobre uma gaze embebida em soro fisiológico e encaminhada imediatamente ao Laboratório de Imunopatologia Cutânea do Departamento de Dermatologia para realização da imunofluorescência direta.
Critérios de Inclusão e ExclusãoForam incluídos no estudo apenas aqueles pacientes que relataram ter pelo menos um episódio de afta(s) por mês por um período mínimo de um ano bem como tenham assinado o termo de consentimento livre esclarecido concordando com os procedimentos adotados.
Foram excluídos aqueles pacientes que apresentaram alterações nos exames sorológicos, ou que nos exames histopatológico e de imunofluorescência direta apresentaram alterações características de outras doenças. Estes pacientes foram encaminhados para tratamento especifico das alterações apresentadas.
Para obtenção de DNA, coletou-se 10ml de sangue total periférico em frasco com EDTA 25mM. As extrações de DNA foram realizadas pelo método Brometo de hexadeciltrimetilamônio/Brometo de dodeciltrimetilamônio (DTAB/CTAB) e as tipificações HLA classe I e de classe II por reação de polimerização em cadeia - sequência específica de oligonucleotídeo (PCR-SSO). A análise foi procedida no Laboratório de Imunologia do Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP (Incor - FMUSP).
A coleta de sangue, extração de DNA e tipificação HLA de ambas as classes do grupo controle já havia sido realizada previamente neste mesmo laboratório.
Análise EstatísticaPara avaliar se houve associação entre a presença dos antígenos HLA e seus subgrupos na doença EAR, aplicou-se o teste Qui-quadrado, sendo uma determinada associação considerada estatisticamente significante quando o nível descritivo do teste (p) fosse menor do que 0,05 (ou 5%). Para estimar a força das associações encontradas, foram calculados os riscos relativos (RR) e seus respectivos intervalo de confiança de 95% (IC 95%).
Os dados foram analisados com o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS® for Windows 10.0; SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA).
RESULTADOSDos 58 pacientes iniciais, 27 foram excluídos do estudo por motivos diversos. Desses 31 pacientes, 17 (54,84%) eram do sexo feminino, 14 (45,16%) do sexo masculino. As idades variaram de 7 a 70 anos, obtendo uma média aritmética de 36,14 anos e desvio padrão de 15,33 (Tabela 1).
Com relação ao tipo de aftas que os participantes do grupo de estudo possuíam, houve predominância daquelas de tipo minor (67,74%). Há que se notar a ausência de pacientes portadores de aftas herpetiformes (Tabela 1).
Com relação à tipagem da frequência de antígenos HLA classe I e II do grupo de estudo, a Tabela 2 mostra a frequência de cada paciente.
As prevalências dos antígenos HLA classe I em que houve diferença estatisticamente significante entre o grupo de estudo (sem levarmos em conta o tipo de afta) e o grupo controle estão apresentadas na Tabela 3. O risco relativo (RR) dos pacientes com EAR que apresentaram as frequências HLA A33, B35 e B81 foi de, respectivamente 3,48 (IC95% 1,38 - 8,8; p = 0,016), 3,48 (IC95% 1,69 - 7,16; p < 0,001) e 8,22 (IC95% 1,67 - 40,41; p = 0,036) vezes o do grupo controle.
As frequências HLA classe II do grupo de estudo que apresentaram maior índice foram Dr7 presente em 10 pacientes (16,13%), Dr11 e Dr 17, as duas últimas presentes em oito pacientes (12,90%). Quando comparados com o grupo controle não houve diferença estatisticamente significante.
Quando os pacientes com EAR são subdivididos de acordo com o tipo de afta, as prevalências das frequências HLA A33 e B35 no grupo com afta minor persistem superiores às do grupo controle de maneira estatisticamente significante, com RR em relação ao grupo controle respectivamente de 3,27 (1,1 - 9,4; p = 0,047) e de 4,73 (IC95% 2,0 - 11,1; p < 0,001), conforme apresentado na Tabela 4. Devido à redução do número de pacientes após realizar a subdivisão, as diferenças nas prevalências das frequências HLA B81 entre ambos os grupos de afta e o grupo controle, e de HLA A33 e B35 entre os grupos de afta major e controle têm chance maior de 5% de se dever ao acaso e, portanto, não foram estatisticamente significantes (p > 0,05).
DISCUSSÃOA Estomatite Aftoide Recorrente é uma doença comum da cavidade oral e possui sua etiologia ainda indefinida20,3,7. Ela pode estar associada a fatores locais e sistêmicos, tendo sua origem com base imunológica, microbiológica ou genética21,22.
De acordo com Jurge et al.4, a incidência da EAR é mais comum na segunda década de vida, entre 20 e 30 anos. Em nosso estudo a incidência também foi maior nessa mesma faixa etária, com um total de oito pacientes (25,80%). Valores muito próximos a este, sete (22,5%), foram obtidos nas duas próximas faixas etárias (30 a 40 anos e 40 a 50 anos).
O sexo feminino foi o que teve maior prevalência de EAR, 54,84%, quando comparado ao sexo masculino, 45,16%. Esses dados estão de acordo com os achados por Axéll e Henricsson23, porém entram em conflito com aqueles levantados por Miller et al.9, em que o sexo masculino teve maior prevalência.
Em nosso estudo as frequências HLA que apresentaram maior índice nos pacientes portadores de EAR foram: HLA-A33, HLA-B35 e HLA-B81. Quando visto de acordo com o subtipo da doença, obtivemos valores estatisticamente significantes para afta tipo minor, nas frequências HLA-A33 e HLA-B35. Para EAR Major nenhuma frequência apresentou valor estatisticamente significante.
Em população inglesa, Challacombe et al.18 encontraram a frequência HLA-B12 associada a pacientes com EAR. Quando analisada em relação aos subtipos de estomatite aftoide a mesma frequência B12 foi significativa estatisticamente apenas para as aftas herpetiformes. Para os tipos Minor e Major nenhuma frequência prevalente foi encontrada pelos autores. Em nosso estudo, devido a sua baixa incidência, não foi possível obter pacientes com o tipo herpetiforme.
A mesma frequência HLA-B12 foi encontrada por Malmström et al.11 ao estudar 14 pacientes finlandeses portadores de EAR. Diferentemente de nosso estudo estes autores não usaram grupo controle e sua amostra de pacientes portadores de EAR era pequena.
Gallina et al.12, com uma amostra de 26 pacientes sicilianos portadores de EAR, encontraram valor aumentado estatisticamente significativo para frequência HLA-DR7. Ao fazer uma análise critica do grupo experimental selecionado, nota-se que foram diagnosticados como portadores de EAR pacientes que tiveram apenas dois episódios de aftas ao ano, característica este não condizente com o quadro clínico de EAR preconizado por Stanley5 e Scully2, que caracterizam como EAR episódios de aftas mensais por pelo menos um ano, o mesmo estabelecido em nosso estudo.
Albanidou-Farmaki et al.14 realizaram um estudo com 106 pacientes gregos portadores de EAR. A frequência HLA-DR5, diferentemente de nossos achados, mostrou-se predominante nestes pacientes. Em contra partida, a frequência HLA-DR4 apresentou frequência reduzida.
Sun et al.24 afirmam que a frequência HLA-DRw9 pode ser considerado como um marcador genético para a EAR na população chinesa. Seu estudo foi composto por 80 pacientes chineses portadores de EAR. Neste trabalho foi realizada apenas tipagem HLA-DR, diferente do nosso estudo onde realizamos também a tipagem HLA-A e B.
Já em população árabe, Jaber et al.25 em um estudo com 22 pacientes portadores de EAR, observaram aumento estatisticamente significante das moléculas HLA-B52 e B44 nos pacientes portadores desta enfermidade quando comparado ao grupo controle. A frequência HLA-B51 tem sido encontrada em alguns trabalhos relacionados a EAR em países como Israel e Coreia26,27.
É importante ressaltar que com o avanço da metodologia de tipificação HLA não é mais utilizado o método sorológico, onde era necessária a presença de ligantes específicos (anticorpos) para evidenciar a presença da frequência HLA correspondente, conforme utilizado por alguns autores11,12,14,18,28,29. Em nosso estudo, utilizamos o método celular, onde são empregadas reações linfocitárias mistas, tornando a tipificação HLA mais fidedigna, e possibilitando a descoberta de novas frequências30.
Por outro lado, segundo Braun Prado et al.31 e Monte et al.32, a frequência HLA-B35 é extremamente frequente na população brasileira em geral, fato que também ocorreu em nosso grupo controle. No entanto, é importante ressaltar que apesar da frequência HLA-B35 também ser encontrada elevada em nosso grupo experimental, este fato não ocorreu ao acaso, pois houve diferença estatisticamente significante na incidência desse gene entre os dois grupos.
Devemos lembrar também que, conforme referido por Louzada-Junior et al.33 a frequência reduzida de tipagens HLA poderia ser um fator de proteção para EAR. Em nosso estudo não anotamos nenhum evento deste tipo.
Por fim, o fato dos diversos trabalhos encontrarem frequências HLA para EAR diversas daquelas evidenciadas em nosso estudo, provavelmente ocorreu devido às populações estudadas serem de diferentes nacionalidades (dinamarqueses, escoceses, israelenses, chineses, coreanos) e origens étnicas distintas das nossas, um país extremamente miscigenado.
Nossos achados mostram que as frequências HLA devem ser realizadas especificamente para cada população, a fim de que possamos mapear os possíveis fatores genéticos envolvidos com a gênese da doença.
Há que se ressaltar em nosso estudo que a ausência de pacientes portadores de estomatite aftoide recorrente do tipo herpetiforme, bem como o baixo número de pacientes portadores de estomatite do tipo major, impediu uma avaliação mais precisa das frequências HLA associadas a estas formas da doença.
De todo modo, a relativamente reduzida casuística de portadores de EAR em nosso estudo não invalida nossos resultados, tendo em vista que as frequências HLA encontradas em nossos pacientes foram muito discrepantes daquelas obtidas no grupo-controle com pacientes não portadores de EAR.
CONCLUSÃOOs resultados de nosso estudo sugerem que a EAR do tipo minor está relacionada às frequências HLA-A33 e HLA-B35 em população brasileira.
AGRADECIMENTOEste trabalho teve o apoio financeiro de Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (Processo 05/51085-0).
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1 Doutor em Otorrinolaringologia, Pós-Graduado.
2 Doutorando em Otorrinolaringologia, Pós-Graduando.
3 Doutor em Nefrologia, Professor.
4 Livre Docente, Professor Titular da disciplina de Imunologia e Alergia Clínica da Faculdade de Medicina da USP.
5 Livre Docente, Professor colaborador da Disciplina de Otorrinolaringologia. Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Endereço para correspondência: Niels Salles Willo Wilhelmsen - Rua Doutor Messuti 136 apto. 92 Vila Bastos Santo André SP 09041-160.
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (Processo 05/51085-0).
Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da BJORL em 16 de janeiro de 2008. cod 5680
Artigo aceito em 11 de agosto de 2008.
