INTRODUÇÃO

A busca por um ideal estético e a melhora dos contornos corporais sempre foi de grande interesse por parte da humanidade. O nariz, pela estratégica posição central que ocupa na face, fica mais susceptível às lesões traumáticas, que podem provocar deformidades faciais e motivar estigmas sociais e preconceitos de várias espécies.

Mesmo tendo função primordialmente respiratória, o nariz possui importante função estética e, por sua posição anatômica de destaque, revela a carga genética nos contornos faciais.

A reconstrução nasal é uma preocupação da Medicina desde a antiguidade. No Império Romano os prisioneiros de guerra eram submetidos à amputação nasal como castigo. Na Índia antiga, os delitos de adultério e roubo eram penalizados com a amputação nasal. Portanto, desde esta época surgiram os primeiros relatos de reconstrução de narizes deformados ou mutilados1.

A chamada rinoplastia moderna iniciou-se em 1860, quando a comunidade científica começou a se preocupar com as bases estruturais do nariz. O sucesso do uso de osso maxilar e frontal para recompor a estrutura nasal levou os pesquisadores à tentativa de uso da ulna, tíbia e costela2.

A partir dos esforços pioneiros no campo da rinoplastia, as técnicas de reconstrução nasal foram aprimoradas continuamente, apresentando atualmente excelentes resultados. Existe uma variedade de opções para a cirurgia reconstrutiva nasal e isto se deve, dentre outros fatores, ao desenvolvimento de materiais aloplásticos estáveis, não-reativos e de fácil disponibilidade3.

Os materiais preferidos para o suporte do dorso nasal devem apresentar resistência adequada, persistência no volume e forma, facilidade de inserção e revestimento, além de suficiente disponibilidade e habilidade para mimetizar o contorno natural do dorso1,2,4-7.

Vários materiais têm sido propostos para o uso na reconstrução nasal. Entretanto, não há consenso sobre qual deles é o melhor. A necessidade de novos estudos fundamenta-se na necessidade de buscar materiais ou substâncias nunca utilizados ou usados em outros locais do corpo humano e que possam se apresentar como soluções viáveis, tanto pela praticidade, como pela economia e diminuição de comorbidades.

Em 1984, através da fermentação de bactérias do gênero Acetobacter, o microbiologista Luís Fernando Xavier Farah conseguiu desenvolver um processo industrial e economicamente viável de produção de celulose bacteriana. A membrana resultante desta síntese, após o processamento, é dotada de permeabilidade seletiva, permitindo a passagem de vapor de água, mas impedindo a passagem de microorganismos. É homogênea, com espessura média de 0,05mm e não contém adesivos ou aditivos. É constituída basicamente por celulose, substância inerte, resistente e insolúvel em todos os solventes orgânicos. Além disso, possui características físicas específicas, tais como: permeabilidade definida a líquidos e gases, resistência à tração e alongamento e peso e estrutura molecular característico e estável. A membrana de celulose vem sendo testada nas mais variadas áreas desde a utilização como pele artificial até em indústrias para confecção de coletes a prova de projéteis de arma de fogo, telas para computadores e papel para preservação de documentos históricos8 (Figura 1).




Na busca de uma alternativa viável para a reconstrução do dorso nasal, com aumento do volume, sem que haja modificações das características habituais de textura e consistência do ponto de vista estético e que não incorra nas desvantagens relativas à colheita e tolerabilidade do material a ser enxertado, decidimos estudar as condições cicatriciais quando do uso de manta de celulose bacteriana produzida por Acetobacter xylinum (Bionext®) como elemento de elevação do dorso nasal.

A manta de celulose Bionext® (ANVISA N 80255120001) é produzida pela Bionext Produtos Biológicos e consiste de uma membrana flexível, semitransparente, amarelada, composta de polissacarídeos sintetizados por bactéria do gênero Acetobacter, sendo biodegradável, não-tóxica, não-pirogênica e estéril. Este composto tem sido utilizado com sucesso como curativo temporário de pele9-11.


OBJETIVO

Avaliar a resposta tecidual à presença de celulose bacteriana produzida por Acetobacter xylinun como material de elevação do dorso nasal de coelhos.


MATERIAL E MÉTODO

Após aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa em animais do Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia no dia 13 de junho de 2006, o estudo foi realizado no biotério do mesmo Instituto com supervisão e acompanhamento veterinário, sendo que os animais permaneceram em caixas apropriadas, com livre acesso à água e à ração comercial padronizada.

Os procedimentos cirúrgicos foram realizados de acordo com as normas da comissão de ética da Unidade de Técnica Cirúrgica Experimental da Santa Casa de São Paulo e obedeceu às normas da Lei Federal nº 6.638 de oito de maio de 1979 e aos princípios éticos na experimentação, postulados pelo Código Brasileiro de Experimentação em animais (COBEA).

Seleção e Tamanho da Amostra

Foram estudados vinte e dois coelhos da raça Nova Zelândia, do sexo masculino, com seis meses de idade, os quais foram acompanhados por um período de três e seis meses, sendo determinados aleatoriamente grupos de estudo de acordo com o tempo de seguimento. A escolha do animal baseou-se na peculiaridade de oferecerem boas condições de manipulação, acompanhamento e avaliação.

Os animais foram divididos em:
a - 2 coelhos para controle do procedimento cirúrgico;
b - 20 coelhos para o grupo de estudo, sendo 10 avaliados após 3 meses de pós-operatório e outros 10 em 6 meses de pós operatório;
c - a determinação de qual grupo de seguimento o animal participaria foi feita por sorteio no dia da eutanásia.

Preparo do Material

Previamente ao procedimento cirúrgico o material derivado de celulose foi esterilizado em solução de glutaraldeído por 10 minutos e lavado em soro fisiológico, sendo que uma tira de 4cm de comprimento e 1cm de largura foi recortada, confeccionada, dobrada e moldada de maneira a constituir um elemento de elevação para ser inserido no dorso nasal (Figura 2).




Procedimento Cirúrgico

Os coelhos foram submetidos à anestesia geral, após jejum pré-operatório de 4 horas. Todos os animais foram anestesiados com quetamina 40mg/kg e hidrocloreto de xylasina 10mg/kg por via intraperitoneal e permaneceram sob ventilação espontânea durante todo o procedimento.

Os animais tiveram a pele do dorso depilada para fotografia padronizada, observação da expansão volumétrica e avaliação das condições clínicas do enxerto.

Uma incisão na região frontal foi utilizada com cerca de 1 cm de extensão horizontal e um plano de dissecção subperiosteal, da região incisada (interorbitária) à ponta nasal, para que um túnel de inserção de cerca de 7cm de comprimento por 1cm de largura fosse obtido. O mesmo procedimento foi realizado no grupo controle, mas não houve inserção do material de celulose para que fosse observada a resposta ao procedimento cirúrgico.

Colocação da Celulose no Dorso Nasal

Uma tira de 4cm de comprimento e 1cm de largura, que foi previamente desenhada e recortada, foi colocada na bolsa de enxertia sobre o dorso nasal.

Após ter inserido na bolsa a tira da manta de celulose, pontos de sutura de mononylon 3.0 foram aplicados na incisão frontal e a cirurgia foi finalizada. No pós-operatório imediato foram aplicados Benzetacil 1ml intramuscular e Dipirona 0,2ml intramuscular e o procedimento foi encerrado.

Eutanásia

Após acompanhamento por 3 meses, 10 coelhos foram escolhidos por sorteio dentre os que receberam o enxerto e 1 dos que não receberam para serem submetidos à eutanásia. Os animais receberam injeção intracardíaca de cloreto de potássio enquanto anestesiados. Através de incisão seguindo a rima lateral da boca, passando pela borda rostral orbitária, contornando-a até alcançar o osso frontal foi retirada a peça da região rostral do animal. Foi mantida a integridade da região dorsal e lateral do nariz desde as narinas até a região frontal. As peças foram armazenadas em formaldeído a 10%, para serem realizados estudos anatomopatológicos. O mesmo procedimento foi repetido com 6 meses de acompanhamento.

Avaliação Histopatológica

Após congelamento dos blocos das peças anatômicas, estes foram submetidos à descalcificação e, em seguida, foram estabelecidos cortes coronais seriados na distância de 5mm da ponta nasal até a sutura frontal e estudados o padrão inflamatório, espessura do enxerto e relação enxerto-hospedeiro.

Foi feito uma padronização prévia dos parâmetros a serem observados por um médico otorrinolaringologista e um médico patologista e a análise das lâminas foi realizada por um único patologista, sem que o mesmo soubesse a que grupo o espécime pertencia. Os cortes foram submetidos à coloração de Hematoxilina-Eosina (HE) e avaliados histologicamente.

Foi feita então leitura em microscópio óptico. Alguns parâmetros definidores de condição inflamatória foram avaliados e graduados. Foram eles:

Congestão vascular:
0 - leve
1 - moderado
2 - intenso

Intensidade do processo inflamatório:
0 - ausente
1 - discreto
2 - moderado
3 - intenso

Exsudato purulento:
0 - ausente
1 - presente

Integridade da manta de celulose:
0 - ausente
1 - íntegro
2 - parcialmente fragmentado
3 - fragmentado

Todas as lâminas de histologia foram documentadas por fotografia digital (Figura 4).




Avaliação Macroscópica

Um parâmetro macroscópico foi também usado para avaliação da elevação do dorso com a colocação da manta de celulose, obtida com a observação do perfil do animal com 3 e 6 meses após o procedimento cirúrgico.

Elevação do dorso:
1- Dorso plano
2- Dorso elevado

Análise Estatística

Os resultados encontrados no exame anatomopatológico foram tabulados em variáveis categóricas e comparados com teste não-paramétrico para amostras independentes de Mann-Whitney entre os diversos pares de intervenções.

O teste de Mann-Whitney é um teste não-paramétrico equivalente ao teste T para amostras independentes, devendo ser utilizado quando os resultados não são distribuídos normalmente, não podendo ser distribuídos através de uma transformação logarítmica. O teste combina e classifica os resultados de duas amostras e calcula a diferença estatística entre a soma dos rankings. Adotamos o valor de 5% para significância estatística (P<0,05).


RESULTADOS

Os achados dos aspectos histológicos da resposta inflamatória representados pelos parâmetros pré-determinados como congestão vascular, exsudato purulento e processo inflamatório agudo e condições da manta de celulose, além do aspecto macroscópico da observação da elevação do dorso nasal, estão apresentados nas Tabelas 1 e 2.




O resultado do teste indicou que não existe diferença significativa (valor-p > 0,05) entre congestão vascular a 90 dias e 180 dias.





O resultado do teste indicou que não existe diferença significativa (valor-p > 0,05) entre exsudato purulento a 90 dias e 180 dias.




O resultado do teste indicou que não existe diferença estatística (valor-p > 0,05) entre o processo inflamatório a 90 e 180 dias.




O resultado do teste indicou que não existe diferença significativa (valor-p = 1) entre elevação do dorso a 90 dias e 180 dias.




O resultado do teste indicou que não existe diferença estatística (valor-p > 0,05) entre integridade da celulose a 90 e 180 dias.

O aspecto macroscópico de avaliação externa do dorso nasal mostrou que todos os animais apresentavam dorso elevado ao final dos 3 meses, sendo que 2 animais do total de 10 apresentavam pele parcialmente necrótica. Do mesmo modo, ao final dos 6 meses todos os animais apresentavam o dorso elevado, com 1 animal com pele parcialmente necrótica.

O aspecto microscópico avaliado pelos parâmetros preestabelecidos mostrava que ao final dos 3 meses a manta de celulose se mostrava íntegra em 5 animais, e em outros 5 animais foi observada fragmentação parcial do material. Já no período de acompanhamento de 6 meses observou-se tendência a fragmentação parcial, porém não houve diferença estatística (p = 0,065).

Em relação aos parâmetros de resposta inflamatória, a congestão vascular não mostrou diferença estatística entre o grupo de 3 meses e o grupo de 6 meses (p = 0,279), como também não foi observada diferença estatística em relação à presença de exsudato purulento nos grupos de 3 e 6 meses (p = 0,684).

Quanto ao parâmetro de processo inflamatório não se observou diferença estatística entre o grupo de 3 e 6 meses (p = 0,317).


DISCUSSÃO

Na Otorrinolaringologia, estudos sobre a viabilidade do uso da celulose bacteriana em regiões mucosas como septo nasal, cornetos e substituições de membranas timpânicas foram realizados e se mostram promissores. O uso de material com estas propriedades ainda não foi devidamente investigado em pacientes submetidos à remodelação nasal. Como os testes em animais não incluíram sua avaliação na região de interesse, entendemos que seria necessário constatar as condições de cicatrização e eficácia da manta de celulose como material de elevação do dorso nasal em coelhos.

A técnica cirúrgica se mostrou adequada e de fácil realização quanto ao implante da celulose no dorso nasal de coelhos. A incisão frontal interorbitária com o descolamento subperiosteal até a ponta nasal permitiu a realização de um túnel de fácil acesso para o implante do material. Uma sensibilidade maior foi observada em alguns animais na região da ponta nasal, mas nada que impedisse a confecção do túnel e a inserção da manta de celulose.

A principal preocupação do estudo era determinar se o material era biocompatível, resultando em resposta inflamatória tolerável e também avaliar se as suas condições de elevação do dorso permaneceriam inalteradas com o decorrer do tempo.

Na literatura observamos que, para a avaliação da biocompatibilidade do enxerto em relação ao tecido hospedeiro, existem vários métodos. Têm-se: cultura de células e tecidos, análise histoquímica12, estudos bioquímicos13,14, estudos histológicos e estudos de perfusão de todo um órgão. Existem também medidas de peso, rigidez, elasticidade, alongamento, quebras na mecânica e alterações na superfície que podem ser revelados na microscopia eletrônica. Mais recentemente, têm-se utilizado exames complementares de radiologia, como por exemplo, a tomografia computadorizada e a ressonância nuclear magnética associada ou não à injeção de marcadores radioativos específicos, para avaliar a resposta do tecido a implantes metálicos que podem se dissolver e causar inflamação14-17. Porém, o método mais utilizado em estudos experimentais é a análise histológica com coloração de hematoxilina-eosina18-28.

Neste trabalho optamos pela análise histológica por ser um método simples e por fornecer informações gerais da resposta tecidual ao material implantado.

O fato de a presença de curativo de celulose não promover uma exacerbação e prolongamento do processo inflamatório pode ser devido às suas características de biocompatibilidade, que promovem uma melhor reação tecidual, não perpetuando o processo inflamatório, o qual já foi demonstrado em diversos estudos na literatura13,14,29,30.

A questão da biocompatibilidade foi investigada através da observação da resposta inflamatória local. A congestão vascular e a presença de exsudato purulento tiveram baixa expressão.

O processo inflamatório encontrado no terceiro mês de acompanhamento não apresentou mudança significativa no sexto mês, mostrando sua relação com o procedimento cirúrgico e não com a presença da manta de celulose. A presença de processo inflamatório representa a participação das células no processo de reparação dos tecidos. Não houve sinais de resposta inflamatória maior nos animais operados com colocação de enxerto do que naqueles que foram operados e não receberam a celulose. Nos animais que receberam a celulose observou-se a formação de um processo inflamatório à custa de polimorfonucleares, com a presença de células gigantes multinucleadas. Entretanto, não houve a formação de um processo inflamatório crônico com predomínio de macrófagos e linfócitos, nem tampouco formação de granulomas após o aparecimento das células gigantes, típicos de reposta imune e de sequestro por macrófagos.

Quanto à qualidade final do enxerto, como material de elevação do dorso nasal, percebemos que houve uma notável modificação na estrutura do dorso nasal dos coelhos no pós-operatório imediato, que se manteve inalterada até o final dos períodos de acompanhamento. O exame do perfil mostrou elevação do dorso em todos os animais dos dois grupos (p=1).

Já o estudo histológico do material enxertado mostrou uma tendência de fragmentação no decorrer do tempo, não havendo, porém, diferença estatística entre o grupo do terceiro mês e o do sexto mês (p=0,065). Salientamos também que esta fragmentação não foi acompanhada de macrofagia, não havendo, portanto, reabsorção da celulose no período de acompanhamento do estudo. O rompimento de propriedades do material implantado poderia sugerir falha de biocompatibilidade, mas a resposta tecidual local não pareceu insatisfatória para considerarmos como tal. A fragmentação da celulose também deve ser analisada como um sinal positivo de incorporação ao tecido, sem ocorrência de resposta inflamatória exacerbada e patológica.

Os estudos de biocompatibilidade de materiais geralmente necessitam de uma avaliação em períodos diferentes pela própria fisiopatogenia da resposta tecidual a um corpo estranho. O tempo de evolução foi importante para avaliarmos o comportamento da manta de celulose, a reação inflamatória local e a condição do dorso nasal neste período estipulado. Como não existem outros trabalhos na literatura sobre o uso deste material para esta finalidade, não dispomos de condições para uma análise comparativa. Talvez novos estudos, com um tempo de acompanhamento maior, possam nos dar mais informações quanto à evolução da fragmentação, observada em algumas amostras, e se viria a afetar a elevação do dorso nasal dos animais.

Neste estudo, pudemos perceber que a manta de celulose teve boa maleabilidade, sendo de fácil manipulação. Uma vez inserida na bolsa subcutânea, emprestou uma consistência natural ao dorso nasal e deu excelente elevação ao perfil nasal. Suas características físicas e de biocompatibilidade, assim como a facilidade de colocação e a provável possibilidade de modelação no ato da inserção, fazem deste produto um possível elemento de ajuda no tratamento que exija adição cartilaginosa e/ou óssea.


CONCLUSÃO

A manta de celulose de Acetobacter xylinum mostrou boa biocompatibilidade e manteve-se estável no decorrer do tempo de estudo, podendo ser considerada um bom material para uso na elevação do dorso nasal de coelhos.


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1 Mestrando pela Santa casa de São Paulo, Médico Otorrinolaringologista.
2 Otorrinolaringologista, Cirurgião de Cabeça e Pescoço. Doutor em Otorrinolaringologia, Prof. Adjunto do Depto. de Otorrinolaringologia da Santa Casa de São Paulo, Coordenador do programa de Pós-Graduação em ORL da Santa Casa de São Paulo.
3 Mestre em Veterinária, Doutoranda da Santa Casa de São Paulo.
4 Professora Instrutora da Santa Casa de São Paulo, Patologista.
5 Doutor em Otorrinolaringologia, Professor Instrutor da Santa Casa de São Paulo. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo.
Endereço para correspondência: Rua Prof. Arthur Ramos 183 3o. andar 01454-011 São Paulo Brasil.
FAPESP.
Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da RBORL em 5 de novembro de 2007. cod. 4944
Artigo aceito em 1 de fevereiro de 2008.