INTRODUÇÃO

Na década passada, as emissões otoacústicas (EOA) evocadas foram empregadas nos estudos dos aspectos mecânicos da função coclear. Dentre os dois tipos básicos de EOA - transientes evocadas (EOATE) e por produtos de distorção (EOAPD)-, as EOAPD são as mais empregadas na prática clínica, sendo capazes de mostrar alterações cocleares iniciais, as quais não são detectadas na audiometria tonal e em outros testes convencionais, na doença de Ménière e em outras alterações freqüentes da orelha interna.

Existem evidências do envolvimento coclear e vestibular mesmo nos estágios iniciais das alterações metabólicas relacionadas à glicose e insulina1-5. Pesquisas em modelo animal focadas nas alterações endococleares têm revelado que a orelha interna praticamente não apresenta energia armazenada, dependendo do suprimento de oxigênio e da perfusão da glicose para manter seu intenso nível de atividade. Portanto, mudanças no metabolismo ou no fluxo sangüíneo têm grande potencial para alterar a homeostase da orelha interna6, e o estudo dessas alterações pode, provavelmente, trazer à luz importantes aspectos para explicar a relação entre distúrbios do metabolismo dos glicídios e desordens da orelha interna.

A utilização da ovelha para propósitos experimentais, inicialmente propostos por Lavinsky & Goycoolea7 para pesquisa em otologia, resulta de trabalhos prévios do nosso grupo8,9, que revelaram similaridades significativas entre ovelhas e humanos em termos de anatomia, histologia e morfometria da orelha, principalmente em relação ao porte das estruturas. Devido a essa similaridade, as ovelhas são especialmente utilizadas para estudos cirúrgicos e investigação da neurofisiologia otológica.

Partindo da hipótese operacional de que podemos utilizar as EOA nas investigações otológicas em ovelhas, o objetivo do presente estudo foi registrar os limiares dos produtos de distorção, bem como as modificações eletrofisiológicas das células ciliadas externas (CCE) cocleares após interferir metabolicamente na cóclea, ao estabelecer hiperinsulinemia aguda.


MATERIAL E MÉTODO

O presente estudo experimental seguiu os princípios internacionais para o manuseio dos animais10 e foi aprovado pelo Comitê de Ética do Grupo de Pós-Graduação da instituição de origem (protocolo nº 04-051).

O cálculo do tamanho da amostra foi determinado com base em um estudo-piloto, incluindo três animais no grupo de estudo e três animais no grupo-controle. Os animais que conseguiam atingir índices acima de 50% de reprodutibilidade nas EOA transientes e com presença dos produtos de distorção (PD) no tempo zero do experimento foram incluídos no estudo.

Quatorze ovelhas macho, da raça Textel, com peso vivo médio de 40kg e idade em torno de 18 meses, foram divididas e randomizadas em dois grupos (controle ou estudo). Os experimentos não produziram desconforto nos animais, pois os mesmos estavam sob sedação e anestesia geral. Visto que este foi um estudo observacional tipo agudo, os animais não foram sacrificados e retornaram ao seu local de origem logo que possível após o final do experimento.

Indução de hiperinsulinemia aguda e anestesia

No grupo-controle (n = 7), após 48 horas de jejum prévio, cada animal recebeu 20ml de solução salina por via endovenosa. EOA foram registradas no tempo zero, de 10 em 10 minutos, até um total de 90 minutos, simultaneamente à coleta sangüínea, para dosagem de glicose e insulina. No grupo-estudo (n = 7), após 48 horas de jejum prévio, os animais receberam insulina regular por via endovenosa em bolo (0,1 U/kg diluída em 10ml de solução salina). EOA foram também registradas no tempo zero, de 10 em 10 minutos, até o tempo total de 90 minutos, simultaneamente à coleta sangüínea, para dosagem de glicose e insulina.

Sedação foi conseguida usando-se 500 mg/kg intramuscular de acepromazina (Univet, São Paulo, SP). Para a indução anestésica, foram usados 15 mg/kg de tiopental (Abbott, Rio de Janeiro, RJ) endovenoso. Para manutenção, utilizamos 600 mg/h de tiopental sódico em infusão contínua em bomba (Nutrimat II, B. Braun, São Gonçalo, RJ). Foi realizado bloqueio local na região auricular junto ao trago usando-se 75 g de cloridrato de bupivacaína 0,75% (Astra, Cotia, SP).

Após 10 minutos da pré-medicação, o animal era induzido com tiopental, entubado com tubo traqueal de 8-9mm e acoplado a carro de anestesia com sistema fechado (Modulus 4000, Narcosul, Porto Alegre, RS), sendo fornecido oxigênio 100%. Foram monitorados os parâmetros anestésicos de saturação de oxigênio, pulso cardíaco (Biox 3700e, Ohmeda, Louisville, CO, EUA), volume corrente, freqüência respiratória (Ventcare, São Paulo, SP) e temperatura retal (Sontemp 400/700, Sheridan, WY, EUA).

Cirurgia para exposição do meato acústico externo

Foi realizada incisão cirúrgica com bisturi elétrico (BMO-870, Medcir, São Paulo, SP), após bloqueio local com cloridrato de bupivacaína 0,75%, de aproximadamente 2cm endo-pré-auricular, com o objetivo de melhor visualização do meato auditivo externo e da membrana timpânica e colocação da sonda para realização das EOA (Figura 1).




Métodos de registro das EOAs

Durante os registros, a temperatura corpórea de cada animal foi mantida em 37 ± 0,5ºC, por intermédio de colchão térmico (Termway). Os níveis de ruído ambiente durante todo o procedimento não ultrapassaram 65,5 dB (A).

As respostas das EOATE (Figura 2) foram registradas pelo aparelho da marca Madsen, modelo Capella, acoplado ao notebook Toshiba Satellite. Os parâmetros utilizados foram realizados no modo fast screen, com estímulo (click) de duração de 40 microssegundos (µs) e intensidade de 80 dB SPL, com polaridade de condensação. Para análise dos dados, consideramos somente os segmentos dos registros na janela de 3 a 12,5ms.




As EOAPD (Figura 3) foram registradas pelo mesmo equipamento utilizado pela EOATE. Os parâmetros utilizados foram de PD1 = 2F1 - F2 (F = freqüência do estímulo sonoro), com uma relação F1: F2 = 1,22. Os níveis de intensidade foram de L1 = 65 e L2 = 55 Db (onde L = intensidade do estímulo sonoro). Para análise das EOAPD, utilizamos os limiares de intensidade (dB) das freqüências de 750, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 6.000 e 8.000 Hz.




Coleta sangüínea de glicose e insulina

Cada animal foi submetido à punção da veia jugular para coleta sangüínea e posterior análise de glicose pelo método enzimático colorimétrico da glicose-oxidase, com a utilização do kit da Labtest e insulina por imunoensaio de eletroquimioluminescência, nos analisadores Modular Analytics E170 (Roche), em intervalos de 10 minutos, até o total de 90 minutos.

Análise estatística

Os dados foram transferidos para um programa estatístico computadorizado - Statistical Package for the Social Science (SPSS), versão 13.0 - para análise. Para o grupo-piloto, foi utilizado o teste t de Student para comparação de dois grupos com magnitude do efeito de dois desvios padrão, ? = 0,05 e poder de 90%, com uma estimativa de seis animais por grupo.

Durante o experimento, foi realizado o teste binomial para avaliar se a ocorrência de valores mínimos nos limiares dos PD, nas freqüências de 750, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 6.000 e 8.000 Hz, nos tempos de 60, 70, 80 e 90 minutos, foi a mesma entre os grupos controle e estudo.


RESULTADOS

Iniciou-se o estudo com 18 animais. Ao longo do desenvolvimento do experimento, dois animais foram excluídos por razões anatômicas do meato acústico externo, um animal por condições anestésicas desfavoráveis, levando à agitação do animal durante o experimento e resultando no deslocamento da sonda da EOA, e uma morte ocorreu durante a anestesia.

Todos os animais se comportaram de maneira dócil durante todos os procedimentos pré-operatórios (indução anestésica). Não houve caso de hemorragia, apenas um caso de morte por aspiração pulmonar no grupo-controle. A recuperação anestésica total ocorreu em aproximadamente 2 horas, sem incidentes. Em seguida, os animais foram transportados ao seu local de origem, onde foram tomadas as providências para a recuperação da ferida operatória.

O método empregado promoveu a hipoglicemia e a hiperinsulinemia desejadas (Figura 4A e Figura 4B).




Não houve modificações nos limiares dos PD no grupo-controle em relação aos níveis de glicose e insulina durante 90 minutos (Figura 5).




Na Figura 6, existe uma diminuição dos limiares dos PD nas freqüências de 750 a 8.000 Hz no grupo-estudo, de acordo com o tempo.




A Tabela 1 mostra os limiares mínimos observados para os PD em quatro tempos, a partir de 60 minutos de registro após a injeção de insulina no grupo-estudo, nas oito freqüências (Hz) estudadas.




DISCUSSÃO

Inúmeras são as técnicas que podem ser utilizadas para monitorar a função auditiva. As EOATE e EOAPD, como representantes das condições de funcionamento das CCE, são testes de aplicação clínica recente e vêm assumindo importância significativa na identificação de alterações cocleares, principalmente por se tratar de um exame objetivo, não-invasivo e de fácil aplicação11,12. Mesmo não determinando o limiar auditivo e não substituindo a audiometria tonal, a imitanciometria ou a audiometria de tronco encefálico, esses novos exames podem detectar sinais iniciais de danos cocleares13.

Na amostra utilizada no grupo-controle, neste trabalho, obtiveram-se respostas das EOAPD em todos os animais. Este achado confirma o fato - já amplamente demonstrado em várias pesquisas, como, por exemplo, as de Robles et al.14 em chinchilas e as de Schrott15 em camundongos - de que as EOAPD estão presentes em ouvidos normais, porquanto as células ciliadas do órgão de Corti, quando saudáveis, geram os PD. Também em humanos, Lopes Filho16 e Coube17 obtiveram respostas do EOAPD em 100% dos ouvidos testados.

Devemos destacar o fato de que, durante os 10 registros executados em cada animal do grupo-controle, observamos uma permanente reprodutibilidade dos achados, mostrando que os resultados são confiáveis e, ainda, que os mesmos permitem estabelecer um conceito de padrão de normalidade para este estudo em ovinos.

Os animais atualmente utilizados para o desenvolvimento de pesquisa e treinamento, como cães, gatos e macacos, têm um porte distinto do homem e são de difícil manuseio no biotério, por serem agressivos e suscetíveis a doenças. Além disso, muitas vezes esses animais são caros e pouco disponíveis; muitos são animais de estimação, e seu uso para treinamento e pesquisa pode determinar repercussões psicossociais e causar conflitos com sociedades protetoras de animais7. Por sua rusticidade, disponibilidade, docilidade, resistência e baixo custo, as ovelhas são animais especialmente adequados para treinamento e experimentação em otologia. Outros trabalhos7-9 mostram semelhanças significativas entre a anatomia, a histologia e a morfometria das orelhas da ovelha e dos seres humanos, principalmente em relação ao porte das estruturas, o que facilita o estudo de ordem cirúrgica, bem como os relacionados com aferições da neurofisiologia otológica. As características e vantagens do uso desse animal puderam ser comprovadas igualmente em nosso estudo. O mesmo aparelho utilizado em humanos pode ser aplicado em ovelhas sem necessidade de adaptações, em comparação com experimentos com cobaias de pequeno porte.

O procedimento anestésico utilizado possibilitou a realização do experimento e garantiu uma baixa morbidade e mortalidade. Apenas um animal (de um total de 18) foi a óbito, devido a uma complicação por aspiração pulmonar.

No presente estudo, a exposição do meato auditivo externo por meio de uma incisão endo-pré-auricular foi de fundamental importância para a visualização da membrana timpânica e para a perfeita adaptação e vedação do meato acústico externo, através da boa fixação da sonda durante o teste das EOA, garantindo, assim, o monitoramento coclear (10 registros em cada animal), sem qualquer interferência durante todo o experimento, das freqüências 750, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 6.000 e 8.000Hz, resultando numa constância na qualidade do registro e, em conseqüência, numa homogeneidade nos resultados. Alguns estudos em ratos18 não conseguiram uma boa fixação da sonda, não permitindo os registros dos EOAPD abaixo de 4.000 Hz.

Apesar de ser um teste objetivo, a amplitude das EOAPD tem mostrado grande variabilidade de indivíduo para indivíduo, provavelmente devido aos diferentes parâmetros de estímulos empregados por cada investigador, como: intensidade dos estímulos primários, diferença ou não entre eles e razão entre as freqüências primárias, além das características individuais de cada orelha, possível influência do sistema nervoso central e presença de outros tipos de EOA.

Existem controvérsias quanto às intensidades ideais a serem empregadas em F1 e F2. Hauser & Probst19 sugerem que fixar L2 menor do que L1 deve resultar na melhora da relação sinal-ruído e aumentar a detectabilidade das respostas de pequenas amplitudes nas orelhas humanas. Estudos em animais apontam que os níveis primários são mais efetivos quando L1 é 5-10 dB maior que L2. Dessa maneira, utilizando os parâmetros de estimulação de PD1 = 2F1 - F2, com uma relação F1: F2 = 1,22, níveis de intensidade de L1 = 65 e L2 = 55 dB e normatização do aparelho Madsen, modelo Capella, conseguimos registrar, pela primeira vez, o perfil dos limiares de EOAPD (DP-gram) em ovelhas (grupo-controle).

Valendo-se das EOATE, onde a estimulação se distribui e atua sobre uma larga porção da membrana basilar, estimulando-a de maneira global, e tendo, portanto, o espectro freqüencial de suas respostas sofrido influência do status de toda a cóclea, utilizamos o parâmetro de reprodutibilidade acima de 50% como critério de inclusão no estudo do tempo zero do experimento de cada animal, pois, a partir desse nível, os achados não são artefactuais e, portanto, tornam-se confiáveis.

A amplitude das respostas captadas nas EOAPD apresentou uma tendência de crescimento em direção às altas freqüências. Em comparação com estudos em humanos17 e em modelos animais18,19, também mostraram, em orelhas normais, uma configuração da função da EOAPD mais ou menos semelhante à aqui relatada. É possível que a distribuição tonotópica coclear facilite essa maior amplitude em agudos, uma vez que estes estão localizados na base da cóclea, região proximal ao local de captação das EOA. Gorga et al.20 sugerem alguns fatores como responsáveis pelas baixas respostas em estímulos de baixas freqüências. Um deles seria a baixa relação sinal/ruído para as freqüências graves; outro fator seria o modo de transferência de energia pelo sistema da orelha média, que apresenta menor amplificação para graves. Ainda segundo o autor, essa característica da orelha média interfere na transmissão dos graves, tanto na direção da orelha média para a cóclea (estímulo) quanto na direção inversa, da cóclea para a orelha média (resposta). O conjunto desses fatores parece fazer com que as medidas das EOAPD captadas na altura do meato acústico externo apresentem amplitudes menores em baixas freqüências, tornando difícil a distinção entre as emissões e o ruído de fundo.

Vários autores conseguiram reduzir a amplitude das EOAPD em cobaias, alguns provocando hidropisia endolinfática experimental por obliteração do ducto e saco endolinfático21, outros22 utilizando microinjeções repetitivas de endolinfa artificial.

No nosso estudo, utilizamos a hiperinsulinemia para modificar eletrofisiologicamente as CCE cocleares. Para demonstrar a gênese dos danos cocleares durante essa condição de hiperinsulinemia aguda, lançamos mão do protocolo de injeção em bolo de 0,1 U/kg de insulina regular, tal como a empregada na técnica do teste de tolerância à insulina23, onde é avaliada a taxa de redução da glicose ao longo de 15 minutos após a injeção de insulina. Nosso estudo permitiu obter uma resposta apropriada para promover a hipoglicemia e a hiperinsulinemia desejadas. As médias dos valores obtidos nas análises das concentrações plasmáticas de glicose e insulina, no nosso grupo-controle, foram as mesmas encontradas na literatura veterinária24,25 utilizando kit comercial empregado em humanos.

O presente estudo permite considerar relevantes os seguintes aspectos:

- Não houve variações nos limiares dos PD no grupo-controle, em relação aos níveis de insulina e glicose nos 10 registros de cada animal e durante os 90 minutos do experimento, mantendo-se estáveis as características do DP-gram, que passa a ser nosso padrão de normalidade em ovelhas.

- No grupo-estudo, houve uma diminuição significativa nos limiares dos PD em relação ao grupo-controle, diminuição esta que foi bem mais nítida nas freqüências acima de 1.500 Hz e após 60 minutos (P < 0,001). Esse dado permite inferir que houve alterações eletrofisiológicas nas CCE, principalmente na espira basal da cóclea.

As CCE são responsáveis pela amplificação sonora de uma freqüência específica, num processo denominado eletromotilidade, resultante das mudanças dos fluidos nas membranas das CCE. Portanto, é possível que os achados deste estudo sejam resultantes da ação da insulina de forma aguda e elevada, e que, após 60 minutos, ela comece a influir na eletromotilidade das freqüências altas e nos padrões iônicos do espaço endolinfático.

Embora as correlações entre as alterações fisiológicas na cóclea e os distúrbios metabólicos dos carboidratos sejam difíceis de se estabelecer, as EOAPD podem eventualmente se tornar o meio para esse fim. Futuros estudos serão necessários para esclarecer a presente observação de uma significativa mudança eletrofisiológica nos limiares dos PD nas altas freqüências, após 60 minutos de hiperinsulinemia aguda induzida.


CONCLUSÃO

Em síntese, as emissões otoacústicas nos animais em estudo tiveram, no grupo controle, uma constante reprodutibilidade dos limiares dos produtos de distorção durante todas as aferições nos mesmos animais, com um padrão de curva (ascendente) semelhante ao da espécie humana. Sendo assim, o método se mostrou adequado para uso em investigações audiológicas e otológicas. No grupo estudo ficou, ainda, plenamente identificado que o hiperinsulinismo agudo foi capaz de provocar relevantes modificações nesses limiares (P < 0,001).


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1 Mestre, Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia - Otorrinolaringologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
2 Doutor em Otorrinolaringologia, Professor Associado, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
3 Doutora, Professora de Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
4 Graduado em Medicina Veterinária, Veterinário, Centro de Pesquisa, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
5 Graduada em Fonoaudiologia, Fonoaudióloga.
6 Acadêmica de Nutrição, Acadêmica de Nutrição, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Trabalho realizado no Centro de Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e vinculado ao Programa de Pós-Graduação em Medicina: Cirurgia, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Endereço para correspondência: Francisco Carlos Zuma e Maia - Rua Ipiranga 95/602 Canoas RS 92010-290.
Tel. (0xx51) 3472-1820 - E-mail: zumaemaia@gmail.com
Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da RBORL em 26 de dezembro de 2006. cod. 3569
Artigo aceito em 10 de fevereiro de 2007.