INTRODUÇÃO

O carcinoma epidermóide corresponde a mais de 90% dos tumores malignos da boca, sendo sua sobrevida modificada conforme o estadiamento da doença. Quando a doença é local, a sobrevida é de 79%, na doença loco-regional de 42% e de 19% na presença de metástases distantes1. As características clínicas, histológicas e mais recentemente biológicas ou moleculares são denominadas de fatores de prognóstico, sendo preditivas de cura e de sobrevida. O fator de prognóstico mais importante no câncer de boca é a presença de metástase cervical o que torna o diagnóstico da metástase fundamental para o planejamento do tratamento oncológico2,3.

A identificação de uma metástase cervical é realizada através do exame físico e de exames complementares, que falham em diagnosticar cerca de 20 a 35% dos pacientes clinicamente negativos2,3. Este falso negativo é considerado elevado e justifica o tratamento preventivo do pescoço. Quando é tratado exclusivamente o tumor primário, na vigência de uma metástase cervical oculta, há sensível redução na sobrevida dos pacientes. A seleção dos pacientes para o tratamento do pescoço é realizada fundamentalmente pelas características clínicas do tumor quanto ao seu tamanho e localização3. As características histopatológicas, como grau de diferenciação celular e espessura do tumor, também auxiliam nesta seleção, porém ainda mantêm falhas elevadas. Aspectos biológicos do tumor estão sendo pesquisados na tentativa de identificar quais os pacientes com maior risco de desenvolver metástase cervical3,4.

A ciclina D1 é uma proteína codificada pelo gene CCND1 localizado no cromossomo 11q13. Esta proteína atua no ciclo celular acelerando a fase G1 e foi descrita como um oncogene em 1991 por Motokura5, o qual observou que o aumento da ciclina desregula o ciclo celular e contribui para gênese do tumor. A presença da ciclina D1 é demonstrada imuno-histoquimicamente no câncer de cabeça e pescoço e, quanto maior sua expressão, menor a sobrevida dos pacientes, sendo assim considerada um fator de prognóstico por muitos pesquisadores, em carcinomas de esôfago, mama, cérvix uterino, cólon, reto e melanomas5,6.

No presente estudo, foi avaliada a expressão da Ciclina D1 em uma série de 45 pacientes com carcinoma epidermóide de boca, e sua associação com a presença de metástase cervical. O objetivo do estudo foi associar a expressão da ciclina D1 como fator de risco para a presença de metástase cervical.

PACIENTES E MÉTODOS

1. Pacientes

Foram estudados 45 pacientes portadores de carcinoma epidermóide de boca, tratados cirurgicamente pelo autor, no período de janeiro de 1991 a dezembro de 2001. Os pacientes foram submetidos à ressecção cirúrgica do tumor em seu local de origem e dos linfonodos cervicais. A cirurgia dos linfonodos cervicais incluiu pacientes que clinicamente não apresentavam metástases (N-), e de pacientes que clinicamente foram diagnosticados como metastáticos (N+).

A pesquisa da expressão da ciclina D1 foi realizada em lâminas histológicas obtidas do tumor primário. Foram revisados os prontuários com coleta de dados clínicos pré-cirúrgicos, coleta de dados do exame anatomopatológico da peça cirúrgica e sua evolução pós-operatória.

Foram excluídos do estudo os pacientes que apresentavam uma ou mais das seguintes situações:

+ Cirurgia sem intenção curativa.

+ Outras neoplasias concomitantes ou história de tumores prévios.

+ Terapia neo-adjuvante (quimioterapia e radioterapia).

+ Pacientes cujos dados de prontuário estavam incompletos.

+ Impossibilidade de definir o estadiamento clínico

2. Imunoistoquímica

Foram obtidos os blocos de parafina que continham os tumores primários dos pacientes investigados. Do bloco principal de cada tumor foram feitos cortes com uma espessura de 4mm.

Os cortes foram colocados em lâminas pré-tratadas com 10% de poli-L-lisina (Sigma, USA) e levados a estufa a 60oC por 24 horas.

Os cortes foram desparafinizados por incubação em xileno por 10 minutos por três vezes, seguido da rehidratação dos cortes em seqüência de etanol em concentrações decrescentes, começando com etanol absoluto, 90%, 80% e 70% por três minutos em cada diluição. A seguir, os cortes foram lavados três vezes em água destilada.

A recuperação dos sítios antigênicos com digestão por tripsina foi realizada após o aquecimento a 37oC em uma solução de tripsina 0,1% contendo 0,1% de cloreto de cálcio em pH 7,8. As lâminas foram incubadas nesta solução por 30 minutos a 37oC, seguido de uma lavagem com água destilada.

A exposição do antígeno em alta temperatura foi realizada pela incubação das lâminas em berço de vidro, com tampão contendo 1mM de EDTA dispostos em ângulo de 45o, em potência média por cinco minutos e 50 segundos, seguida de oito minutos em potência baixa (Microondas Panasonic, 1.500W).

Após a recuperação dos sítios antigênicos, procedeu-se o bloqueio da peroxidase endógena com 3% de H2O2. Após 10 minutos de incubação, as lâminas foram lavadas três vezes com água destilada e uma vez com PBS pH 7,2. Os cortes foram incubados por uma hora com o anticorpo primário anti-Ciclina D1 (Dako, USA) na concentração 1:20, seguido de duas lavagens em PBS. Após a incubação com o anticorpo primário, os cortes foram incubados com o sistema biotina-estreptavidina (Dako LSABâ2 System, USA) que consiste na incubação com anticorpo anti-mouse/anti-rabbit biotinilado por 10 minutos, seguido de uma lavagem em PBS e posterior incubação com estreptavidina conjugados a peroxidase. Após 10 minutos de incubação, as lâminas foram lavadas em PBS e uma solução com diaminobenzidina (Dakoâ Liquid DAB Substrate Chromogen System, USA). Após lavagem em água destilada, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina de Harris por 15 segundos, lavadas em três banhos de água e mergulhadas em uma solução de amônia 37 mM. Após a contra-coloração, a lâminas foram lavadas em três banhos de água morna, seguido de desidratação em concentrações crescentes de etanol (80%, 90% e puro, respectivamente) por três minutos em cada diluição. Após dois tratamentos por cinco minutos em xileno os cortes foram cobertos com lamínulas montadas em Entellanâ (Merck, Alemanha).

As lâminas foram analisadas sob microscópio ótico com o objetivo de avaliar a expressão da ciclina D1.

A medida da expressão da ciclina D1 foi realizada através de método denominado estereológico, cujo objetivo é de determinar parâmetros quantitativos a partir de cortes bidimensionais de estruturas antômicas microscópicas tridimensionais, valendo-se da geometria e da estatística7,8.

A expressão da ciclina D1 foi medida pela contagem do número de núcleos corados divididos pela área em mm2 e o valor indicado por Qa 9.

A análise das lâminas foi feita em microscópio óptico Olympus AX-70 (Japão), acoplado a uma câmara de vídeo. As imagens obtidas eram transferidas a um computador e as contagens feitas com o auxílio do Programa Image Pro Plus versão 4.1 (Media Cybernetics, USA). Sobre uma imagem obtida com a objetiva de 20x era aplicada uma grade que dividia a mesma em nove campos iguais conforme a Figura 1.



De cada lâmina foram obtidos cinco valores e calculada uma média dos cinco Qa obtidos.

3. Análise Estatística

As variáveis quantitativas foram descritas por média e desvio padrão, enquanto que para as varáveis qualitativas utilizaram-se percentuais. A comparação das variáveis quantitativas nos grupos foi realizada pelo teste t de Student e no caso das variáveis qualitativas pelo teste do Qui-quadrado. Medidas de associação como o odds ratio e o risco relativo com seus respectivos intervalos de confiança foram complementarmente realizados. Para ajustar a associação entre ciclina e metástase frente a diversos potenciais fatores de risco, utilizou-se a regressão logística multivariada.

As curvas de sobrevivência foram calculadas com o método de Kaplan- Meyer. As mortes que não foram decorrentes do tumor primário ou suas metástases não foram consideradas como falha de tratamento e sim como observações censuradas. As diferenças entre as curvas de sobrevivência foram comparadas pelo teste log rank. Para ajustar simultaneamente os efeitos dos diversos fatores considerados e sua relação com a ocorrência de óbito, foi utilizada a regressão de Cox. Os valores de P menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos, sendo que nos modelos multivariáveis considerou-se P menores que 0,1.

Para a análise estatística, os dados foram processados e analisados com o auxílio dos programas SPSS (Statistical Package for Social Science) for Windows 11.0 e Excel 97.

4. Ética

O estudo está em conformidade com os itens III.3.i e III.3.t das Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas envolvendo Seres Humanos (Resolução CNS 196/96), bem como a diretriz 12 das Diretrizes Éticas Internacionais para Pesquisas Biomédicas Envolvendo Seres Humanos (CIOMS 1993).

Foram respeitados os princípios enunciados na Declaração de Helsinque (WORLD MEDICAL ASSOCIATION, 1996), mantendo-se em sigilo a identidade dos pacientes, cujos dados foram identificados apenas pelo número de registro no projeto.

O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (Protocolo número 298/01 - CEP).

RESULTADOS

As características clínicas, histológicas e a expressão da ciclina D1 dos 45 pacientes estudados podem ser observadas na Tabela 1.



A ciclina D1 foi positiva em 15 (33,3%) casos e negativa nos demais 30 (66,7%). A média do número de núcleos marcados (Qa) variou entre 0,15 e 1,24 nos casos positivos. A presença da proteína no núcleo da célula pode ser observada na Figura 2.



A expressão da proteína no citoplasma da célula também foi observada em três pacientes.

As associações e correlações entre os pacientes com metástase (pN+) e sem metástase (pN-) foram realizadas com as características clínicas, histológicas, hábitos, variáveis demográficas e ciclina D1 e podem ser observadas na Tabela 1. A análise multivariada para avaliar o risco de associação da ciclina D1 com outros potenciais fatores de risco foi realizada e está apresentada na Tabela 2.

A sobrevida foi analisada em função da expressão da ciclina D1 e da presença de metástase em meses através de uma curva de sobrevida cujo desfecho considerado foi o óbito por câncer de boca, que ocorreu em sete situações. Os resultados podem ser observados nas Figuras 3 e 4.





O efeito da ciclina D1 foi ajustado frente a potenciais fatores de risco para a avaliação da sobrevida e está mostrado na Tabela 3. O efeito da ciclina D1 na sobrevida ajustado pelo modelo de regressão de Cox multivariável contendo os fatores estadiamento clínico, comprometimento da língua, diferenciação celular, embolização vascular e infiltração nervosa foi estudado e está apresentado na Figura 5.



DISCUSSÃO

A ciclina D1 foi expressa em 15 (33,3%) pacientes da amostra estando de acordo com os resultados publicados que variam entre 30 e 40%10-12, embora por uma metodologia distinta de leitura da imunoistoquímica. A literatura sobre câncer e ciclina D1 avalia a presença da ciclina através da contagem de núcleos marcados por grupo de células neoplásicas, que geralmente variam entre 500 e 1000 células, em percentuais. Por este método o pesquisador necessita contar um total de células neoplásicas, independente de estarem marcadas ou não, e a seguir, recontar as células que expressam a proteína, calculando o percentual. Além de ser um método trabalhoso, ocasiona maior risco de distorções na contagem. A escolha do ponto de corte, para separar a expressão positiva da negativa da ciclina D1, é arbitrária. Han et al.13, consideram a positividade quando ocorrer mais de 5% de núcleos marcados. Ravi et al.14, Itami et al.11 e

Capaccio et al.12, consideram a expressão da ciclina D1 significante quando presente em mais de 10% das células tumorais. El-Naggar et al.15 consideram valores superiores a 50% como uma superexpressão desta proteína. Mineta et al.16 consideram valores entre 0-50% de baixa expressão e acima de 50% de alta expressão. Schoelch et al.10 utilizam o escore negativo quando não há expressão, + para até 33% de expressão, ++ entre 33 e 66% e +++ acima de 66% de expressão da proteína nas células tumorais.

O método estereológico utilizado neste trabalho avalia a expressão da proteína nos núcleos por área de tumor, sendo mais confiável8,9. A expressão da proteína no citoplasma da célula também foi observada como já descrito em outros estudos17.

A ciclina D1 pode estar expressa com distintos graus de intensidade. O termo "alta expressão" é definido pela marcação de mais de 50% das células neoplásicas10. No presente estudo, os resultados do Qa obtidos nos 15 pacientes positivos variaram de 0,15 a 1,27 e não foram significativas as diferenças dos valores encontrados. Estabelecer um ponto de corte para categorizar a expressão da ciclina em baixa e alta expressão não foi possível face ao tamanho da amostra de pacientes, porém a análise quantitativa dos valores do Qa foi realizada.

A expressão da ciclina D1 nos 15 pacientes positivos não foi constante em toda a área de superfície do tumor. Em todos os casos, a análise da expressão da proteína foi realizada na região de maior marcação na lâmina, existindo áreas de tumor que não expressaram a proteína. A não-uniformidade da marcação pode ser justificada pelo fato de que cerca de 20% das células neoplásicas estejam em mitose18. Face à distribuição assimétrica desta expressão, poder-se-ia contestar os estudos em que os pesquisadores utilizam material de biópsia, como já relatado por Michalides et al.19, onde falsos negativos de expressão da ciclina D1 foram observados em material de biópsia quando comparado com a peça operatória, porém mais estudos são necessários para medir qual é a real sensibilidade da expressão da ciclina D1 em material de biópsia comparado com uma peça operatória. Isto é relevante, pois a existência de falsos negativos no material de biópsia comprometeria a aplicação clínica deste marcador na decisão de um tratamento, como por exemplo, a indicação ou não de um esvaziamento cervical em um paciente clinicamente N0.

Quanto ao gênero, fumo e álcool, não houve associação com a presença de metástase cervical e com a invasão da cápsula do linfonodo, o que confirma não serem fatores de risco para metástase cervical16.

A idade também não esteve relacionada com a presença de metástase cervical e com a invasão da cápsula do linfonodo, embora os pacientes muito jovens e os idosos desenvolvam tumores com comportamento mais agressivo20.

Quanto à localização, também não houve associação com a presença de metástases. Os 14 pacientes T1 e T2 com carcinoma epidermóide de língua apresentaram metástase em seis casos, enquanto que os demais 14 pacientes T1 e T2, classificados como outros locais da boca, apresentaram metástase em seis casos. A localização não apresenta importância quando os tumores são grandes, como os tumores T3 e T4 que individualmente já acarretam elevado risco de metástases.

A localização do tumor na boca esteve associada com a invasão da cápsula do linfonodo. Os tumores que comprometiam mais de uma localização na boca tiveram um maior comprometimento da cápsula do linfonodo com um valor P 0,049.

Doze dos 28 pacientes T1 e T2 apresentaram metástases histológicas (42,8%), um valor próximo do esperado, que é de 20 a 40%. Quanto aos 17 pacientes T3 e T4, 11 apresentaram metástases (64,7%) concordando com a literatura21. Não houve significado estatístico entre o tamanho do tumor e a presença de metástase (P = 0,265). Também não foi significativa a associação do tamanho do tumor e a invasão da cápsula do linfonodo metastático (P = 0,089).

Quanto à classificação N, o exame histológico demonstrou que dos 25 casos negativos, oito (32%) eram falsos negativos e 17 (68%) verdadeiramente negativos. Quanto aos 20 pacientes N+, o exame histológico revelou que cinco (25%) pacientes eram falsos positivos e em 15 (75%) pacientes foi confirmada a presença de metástase cervical. O valor P encontrado foi de 0,001 para a presença de metástase cervical e de 0,047 para a invasão de cápsula. O número de falsos positivos de 25% corresponde ao descrito na literatura, que é de 20%, enquanto que o de falsos negativos foi de 32%, quando o valor referido na literatura é entre 20 a 35%22,23. A estratificação dos pacientes com metástase não foi estudada neste trabalho, face ao pequeno número de pacientes alocados em cada subdivisão N.

O estadiamento clínico foi significativo na associação com a presença de metástase cervical. Quando é definido o estadiamento de um paciente com carcinoma de boca, está sendo considerado o tamanho do tumor e a presença clínica de metástase pela palpação cervical. Uma vez que os pacientes classificados em N positivo estão no estadiamento III e IV, o valor encontrado não é surpreendente estando diretamente associado à incidência de falsos positivos e falsos negativos na palpação cervical, que no presente estudo foi de 25% e 32% respectivamente. A palpação cervical e a classificação T isoladamente não apresentaram significância, o que justifica a utilização do estadiamento.

O grau de diferenciação celular não esteve associado com a presença de metástase cervical ou com a invasão da cápsula do linfonodo. A presença de apenas um paciente com carcinoma epidermóide bem diferenciado impossibilitou a observação da relação entre o grau de diferenciação e o risco de metástase.

A infiltração de bainhas nervosas não esteve associada à presença de metástase cervical ou à invasão da cápsula do linfonodo. A presença de infiltração de bainha nervosa ocorreu em 14 (60,9%) dos 23 pacientes com metástases, porém sem significado estatístico. Também não houve associação da infiltração de bainha nervosa com a invasão da cápsula do linfonodo.

A embolização vascular foi preditiva quanto à presença de metástases. Woolgar24 encontrou 78% de invasão vascular nos pacientes N positivos e de 70% de infiltração de bainhas nervosas de uma amostra também de 45 pacientes com carcinoma epidermóide de boca. No presente estudo foi encontrado o valor de 60,9% para ambas as situações, porém com significados diferentes quando observados os resultados dos adequados testes de significância estatística, o que demonstra a relevância dos testes na análise dos dados, evitando assim, interpretações equivocadas.

A expressão da ciclina D1 não está associada à presença de metástase. A ciclina D1 quantificada pelo valor do Qa também não modificou estes resultados. A ausência de trabalhos na literatura que utilizam o método estereológico impossibilita a comparação de resultados quantitativos. A ciclina também não esteve associada à invasão de cápsula do linfonodo metastático.

Na literatura, a associação entre a expressão da ciclina D1 e a presença de metástase cervical é ambígua. Os resultados do presente estudo concordam com os obtidos por Han et al.13, Michalides et al.19,25 e Bellacosa et al.26. Já os trabalhos de Frachiolla27, Itami11, Masuda28, Tapia et al.29, Capaccio et al.30 e Mineta et al.16 demonstraram que a ciclina D1 está associada à presença de metástase cervical. Os resultados são contraditórios e os motivos podem ser: diferenças de expressão da ciclina D1 nos diferentes órgãos, o estado da peça cirúrgica, como emblocamento e tempo no formal até ser fixado, o ponto de corte para definir o que é superexpressão da proteína e uma metodologia padrão de leitura evitando subjetividade na interpretação.

A análise multivariada da ciclina D1 com os fatores de prognóstico de maior relevância não modificaram os resultados, demonstrando que a expressão da ciclina D1 é independente dos demais fatores estudados, concordando com os achados de Capaccio et al.30 e Mineta et al.16.

A curva de sobrevida dos 45 pacientes da amostra demonstra que os pacientes positivos para ciclina D1 apresentam uma tendência de menor sobrevida que os pacientes negativos, embora não tenha um forte significado estatístico.

A análise da sobrevida quanto à presença de metástase, revela que os pacientes com metástase cervical apresentam menor sobrevida, e confirma o significado da metástase cervical como fator prognóstico no câncer de boca3,31-33.

A análise multivariada identifica que a presença de ciclina D1 e a metástase cervical são independentes quanto à sobrevida, concordando com os achados de Han et al.13. Estes autores não encontraram associação entre a ciclina D1 e a presença de metástase em câncer gástrico e encontraram associação com a sobrevida dos pacientes. Michalides et al.19,25 estudaram carcinomas de cabeça e pescoço e Bellacosa et al.26 pacientes com câncer de laringe e também não encontraram correspondência entre a presença de metástases com a expressão da ciclina D1, porém encontraram com a sobrevida dos pacientes.

Neste estudo a presença de metástase cervical foi significativa para diminuir a sobrevida, enquanto que a ciclina D1 não teve a mesma significância estatística, mostrando apenas uma tendência de que os pacientes com maior expressão da ciclina tiveram pior sobrevida.

CONCLUSÕES

O presente estudo permitiu concluir que:

a. A expressão da ciclina D1 parece ser independente das características clínicas e histológicas do carcinoma epidermóide de boca.

b. A ciclina D1 provavelmente não está associada com a presença de metástase cervical.

c. A presença de embolização vascular e o estadiamento clínico foram os fatores mais significativos como preditivos de metástase cervical nos casos estudados.

d. A presença de metástase cervical foi significativa na sobrevida dos pacientes estudados, enquanto que o mesmo não foi observado com a ciclina D1.

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1 Otorrinolaringologista e cirurgião de cabeça e pescoço. Mestre em medicina pela PUCRS. Membro do Serviço de otorrinolaringologia e cirurgia de cabeça e pescoço - PUCRS - Porto Alegre.
2 PhD. Coordenadora do Laboratório de Biologia Celular e Doenças Respiratórias do Instituto de Pesquisas Biomédicas e Professora da Faculdade de Medicina da PUCRS.
3 Biólogo e Mestre em Educação (PUCRS), Doutor em Medicina (Aichi Medical University, Japão), Professor Titular da Faculdade de Biociências.
4 Doutorando Clínica Médica e Ciências da Saúde. Farmacêutico Bioquímico. Otorrinolaringologista e Cirurgião de Cabeça e Pescoço. Porto Alegre RS PUCRS - Hospital São Lucas e Hospital Mãe de Deus - Porto Alegre RS.
Endereço para correspondência: Gerson Schulz Maahs - Av. Palmeira 95/402 Bairro Petrópolis 90470-300 Porto Alegre RS.
Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da RBORL em 24 de janeiro de 2006. cod. 1693.
Artigo aceito em 2 de novembro de 2006.