INTRODUÇÃO

A neoangiogênese é um processo importante para o desenvolvimento dos tumores e está relacionada com a metastatização e o prognóstico em diferentes tipos de neoplasias malignas1-4. A resposta imunológica, além da ação antitumoral, participa da modulação da angiogênese e de outros mecanismos relacionados à invasão e crescimento das neoplasias. Os linfonodos regionais freqüentemente apresentam sinais de reatividade, mas o seu significado ainda é desconhecido5,6. Este estudo tem por objetivo avaliar a densidade microvascular e a reatividade linfonodal nas metástases cervicais de tumor primário oculto, relacionando estes achados com outras variáveis histológicas e clínicas, considerando que esta doença representa um modelo clínico adequado para o estudo das metástases.

MÉTODO

Foram revisados os prontuários dos pacientes com metástase cervical de tumor primário oculto atendidos no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Heliópolis entre 1983 e 2000. Foram selecionados os pacientes submetidos a esvaziamento cervical, nos quais se confirmou a presença de carcinoma epidermóide. Foram incluídos todos os pacientes que apresentavam amostra tecidual disponível para análise e seguimento igual ou superior a 12 meses após o tratamento inicial, totalizando 19 casos. Destes, 16 pacientes pertenciam ao gênero masculino e 3 ao feminino. A idade média foi de 55 anos. O tabagismo e o etilismo estavam presentes em 16 e 13 casos respectivamente. Quanto ao estadiamento da metástase cervical, os pacientes foram estadiados conforme os critérios da classificação TNM de 2002 (UICC-AJCC), sendo que 1 paciente apresentava estádio N1, 8, N2 e 10, N3. A média de linfonodos obtidos no esvaziamento cervical foi de 22,4 linfonodos, variando de 4 a 49. A reatividade foi avaliada em 427 linfonodos e a densidade microvascular em 60 linfonodos com metástases.

A análise histológica convencional avaliou o grau de diferenciação, presença de necrose tumoral, desmoplasia e reatividade linfonodal. A avaliação da reatividade linfonodal aplicou os critérios usados por Berlinger et al. e Klimek et al., descritos a seguir5,7:

A - Hiperplasia paracortical: aumento da celularidade na área paracortical.

B - Hiperplasia folicular: aumento do número e tamanho dos folículos linfóides na zona cortical do linfonodo, formação de folículos secundários com centros germinativos proeminentes.

C - Hiperplasia sinusal: hiperplasia das células endoteliais com distensão dos sinusóides medulares e histiocitose.

D - Linfonodo não-estimulado: linfonodo sem proliferação linfocitária.

E - Linfonodo depletado: diminuição da população linfocitária e fibrose difusa no linfonodo.

O padrão de reatividade foi classificado conforme definido por Amar et al., avaliando as zonas cortical e paracortical do linfonodo, considerando o padrão existente em mais de 2/3 dos linfonodos reativos. Não havendo predomínio, a hiperplasia foi considerada mista. A falta de reatividade em mais de 80% dos linfonodos definiu o padrão não-reativo. A hiperplasia sinusal e a histiocitose foram consideradas separadamente. A histiocitose foi definida pela presença de macrófagos nos sinusóides, caracterizados por núcleos grandes, nucléolos evidentes e citoplasma eosinofílico.

A análise histológica convencional considerou o grau de diferenciação, presença de necrose tumoral e desmoplasia.

As reações imunohistoquímicas foram realizadas na seguinte sequência:

1. Anticorpo primário (Monoclonal Mouse Anti-Human CD34 Class II, Dako AS, M7165, Denmark) diluído 1:100 em PBS, por 18 horas a 4°C em câmara úmida.

2. Anticorpo secundário (Biotinylated Goat Anti-Mouse/Rabbit Ig, do conjunto StreptAB Complex/HRP Duet Mouse/Rabbit, Dako AS, K492, Denmark) diluído 1:200, por 30 minutos a 37°C.

3. Complexo reagente A (Streptavidin) e reagente B (Biotinylated Peroxydase) diluído 1:200, por 30 minutos a 37°C.

4. Solução de 3,3'-Diaminobenzidina Tetrahidrocloreto 60 mg% (Sigma, D5637, USA), 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO), 1mL de H2O2 6% e 100 mL de PBS, por 5 minutos a 37°C, ao abrigo da luz.

A contagem dos vasos foi realizada à microscopia óptica, em 5 áreas de maior densidade vascular intratumoral (hot spot). Foi selecionada uma área de 0,4 mm2 em cada hot spot, analisados com auxílio do programa de análise de imagens Image Tool 2.0 (University of Texas Health Science Center, USA), contado o número de vasos em aumento de 100X e somado o valor obtido nas 5 áreas (2 mm2).

Foi avaliada a relação entre a reatividade do linfonodo e a densidade microvascular nas metástases, grau de diferenciação, desmoplasia, necrose, características clínicas e evolução dos doentes.

Na análise estatística foi utilizado o método de sobrevida atuarial de Kaplan-Meier e as diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste de Gehan. Nas variáveis quantitativas, as diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste U de Mann-Whitney e pelo teste de Kruskal-Wallis. A correlação entre as variáveis quantitativas usou o teste de Spearman. Para as variáveis qualitativas foi utilizado o teste exato de Fisher e o teste da diferença entre duas proporções, considerando valores bicaudais de p. Os cálculos foram realizados no programa Statistica 5.1 (Statsoft Inc., USA) e, em todos os testes, foram consideradas significativas as diferenças cujos valores de p foram iguais ou inferiores a 0,05.

RESULTADOS

A reatividade foi avaliada em 427 linfonodos, dos quais 102 apresentavam hiperplasia paracortical e 122, hiperplasia folicular. A hiperplasia sinusal foi observada em 93 linfonodos, provenientes de 15 pacientes, os quais também apresentavam histiocitose sinusal. A hiperplasia paracortical, considerando sua presença também nos casos de padrão misto, foi observada em 90% dos pacientes com menos de 55 anos de idade e em 44% dos pacientes com idade igual ou superior a 55 anos, p=0,05.

A densidade microvascular mediana foi de 91,5 vasos/mm2, variando de 28 a 145 (figura 1). Considerando o grau de diferenciação independentemente em cada linfonodo e a sua respectiva densidade microvascular, os tumores bem ou moderadamente diferenciados apresentaram mediana de 55 vasos/mm2 (Q25-75%= 38-90), enquanto que os tumores pouco diferenciados apresentaram 53 vasos/mm2 (Q25-75%= 43-116), p=0,85.

No seguimento, um tumor primário foi diagnosticado em 3 pacientes, 10 apresentaram recidiva no pescoço e em 4 casos foram detectadas metástases à distância. Ao todo, 5 pacientes receberam tratamento de resgate, sendo 4 com cirurgia e 1 com radioterapia; os demais receberam tratamento paliativo. Entre os submetidos ao resgate, 3 tiveram a doença controlada no segundo tratamento.

A densidade microvascular mediana nos casos que desenvolveram ou não metástases a distância foi 73 vasos/mm2 (Q25-75%= 55-108) e 99 vasos/mm2 (Q25-75%= 28-145) respectivamente, p=0,59.

A sobrevida livre de doença para todo o grupo foi de 52% a dois anos e 44% a 5 anos. Os pacientes assintomáticos tiveram um acompanhamento médio de 61 meses (Figuras 2 e 3).

Não foi observada relação significativa entre a idade dos pacientes e a densidade microvascular das respectivas metástases (Figura 4). A relação entre a densidade microvascular e as demais variáveis analisadas pode ser verificada na tabela 1.



DISCUSSÃO

A primeira questão que se apresenta nos casos de metástases cervicais de tumor primário oculto é relacionada à origem do tumor. Os pacientes com tumor primário oculto apresentam as mesmas características epidemiológicas observadas nos pacientes com tumores primários das vias aerodigestivas superiores. Adicionalmente, foram identificadas alterações genéticas similares na mucosa oral "normal" e nas metástases linfonodais em alguns casos de tumor primário oculto que, analisadas dentro do contexto da cancerização de campo e da expansão clonal, são fortes evidências para suportar a hipótese de sua origem no epitélio das vias aero-digestivas superiores, com possível regressão ou dormência tumoral no sítio primário8-10. Vários estudos reportam a associação entre a densidade microvascular nos tumores primários e a presença de metástases3,4. Como a neoangiogênese é uma característica importante para o crescimento das metástases, a maior angiogênese sugere uma vantagem adquirida pela seleção clonal. Foi relatada uma relação inversa entre a densidade microvascular no tumor primário e nas respectivas metástases, sugerindo que a maior angiogênese em um sítio poderia contribuir para a inibição da angiogênese à distância11,12. A hipótese de que as metástases de tumor primário oculto poderiam inibir o crescimento do tumor primário seria suportada por elevada densidade microvascular, mas foi encontrada grande variação no presente estudo. Esta grande variação não inviabiliza a hipótese de que o controle sistêmico da neoangiogênese esteja implicado na etiogenia do tumor primário oculto, mas este não deve ser o único mecanismo envolvido.

Outra questão importante diz respeito ao significado da densidade microvascular tumoral, especialmente quando se usa a técnica de contagem nos hot spots3,13. O tumor pode crescer ao longo da vasculatura existente ou remodelar o estroma, promovendo a neoangiogênese, mas a maior densidade microvascular não significa que o tumor tenha maior aporte sangüíneo. Os tumores necróticos podem apresentar maior neoangiogênese, possivelmente desencadeada pela maior resposta inflamatória neste tipo de morte celular14. Para que ocorra a difusão de oxigênio e nutrientes, as células podem distar aproximadamente 110mm do vaso, medida que é alcançada com baixa densidade microvascular13. Os linfonodos apresentam grande densidade microvascular, que supera a densidade observada nas metástases, assim a alteração no fluxo sangüíneo ocasionada pelo crescimento das metástases também reforça a idéia de que o tumor modifica a estrutura vascular e a dinâmica do fluxo15,16. Infelizmente, a técnica empregada não permite distinguir os vasos neoformados daqueles já existentes.

Não foi encontrada correlação entre a idade e a densidade microvascular, mas a reatividade paracortical foi encontrada com mais freqüência entre os pacientes com idade inferior a 55 anos. Uma vez que é esperada menor angiogênese com o envelhecimento, este achado sugere que a neoangiogênese na metástase esteja relacionada a uma maior ação inibitória17.

A reatividade linfonodal, manifesta por hiperplasia paracortical ou folicular, foi relacionada a melhor prognóstico em diferentes estudos5,6,18. Nos diferentes estudos não se formou um consenso quanto ao tipo de reatividade relacionado ao melhor prognóstico, bem como ao método para classificar uma reatividade heterogênea. Não é incomum encontrar mais de um padrão no mesmo linfonodo ou diferentes padrões em diversos linfonodos de um mesmo paciente, o que torna difícil a categorização dos mesmos e poderia explicar os diferentes resultados. A quase totalidade dos pacientes com tumor primário oculto apresentava linfonodos reativos. A resposta imune está relacionada à liberação de substâncias promotoras da angiogênese e, no presente estudo, nos casos que apresentavam reatividade paracortical foram observadas as maiores densidades microvasculares, embora estatisticamente não significante. Nos tumores da cabeça e pescoço, os linfonodos com hiperplasia folicular ou paracortical se localizam na proximidade do tumor, ou seja, aqueles que habitualmente apresentam metástases, portanto, é possível que a resposta imune favoreça o implante e o crescimento das metástases no linfonodo7. Adicionalmente, a resposta imune poderia ser responsável pela regressão do tumor primário.

A histiocitose e a hiperplasia sinusal foram encontradas na maioria dos pacientes. Esta última é considerada uma reatividade inespecífica e associada à disfunção imunológica7. Por estar presente na quase totalidade dos pacientes, não foi possível determinar a sua relação com as outras variáveis estudadas. Os linfonodos com hiperplasia sinusal são mais freqüentes nos linfonodos mais distantes do tumor, assim não pode ser descartada a possibilidade de que o tumor ou a resposta imune nos linfonodos da primeira estação de drenagem possam desencadear um efeito imunossupressor a jusante no fluxo linfático7. Este hipótese é reforçada pelo fato de que os linfócitos provenientes de linfonodos na área de drenagem do tumor apresentem menor ação citotóxica do que os linfócitos do sangue periférico19. Os macrófagos (histiócitos) têm função importante na remodelação da matriz extracelular e na modulação da angiogênese e da resposta imune, e também podem modificar a expressão gênica e o comportamento das células tumorais, aumentando o seu potencial de invasão. Sua ação poderia tanto favorecer como inibir o crescimento tumoral20,21.

A sobrevida livre de doença foi semelhante entre os pacientes com alta ou baixa densidade microvascular. Os estudos que relacionaram a maior densidade microvascular com pior prognóstico avaliaram tumores primários4. Como a maior densidade microvascular está associada à presença de metástases, isto poderia explicar a pior evolução destes casos. Em relação à radiossensibilidade, foi relatado pior resultado nos tumores primários que apresentavam valores extremos de densidade microvascular, o que poderia refletir a modulação regional da neoangiogênese22,23. No presente estudo, o tratamento multimodal pode ter mascarado esta relação. Considerando a grande variação da densidade microvascular, também encontrada em outros estudos, a amostra foi insuficiente para estabelecer relações significativas com outras variáveis clínicas ou histológicas24,25.

Concluindo, a reatividade linfonodal e a densidade microvascular nas metástases de tumor primário oculto não apresentaram relação entre si ou com a evolução da doença. Nestes pacientes, onde pode ser desconsiderado o efeito do tumor primário nos parâmetros estudados, parece que a metástase linfonodal, que é um dos fatores prognósticos mais relevantes nos carcinomas das vias aero-digestivas, já reflete uma seleção clonal na qual a neoangiogênese passa a ter importância secundária. Adicionalmente, a classificação empregada pode ter mascarado relações existentes apenas no microambiente da metástase. A densidade microvascular reflete uma forma de interação com os tecidos adjacentes, fundamental para o crescimento do tumor, que pode ter repercussão regional ou sistêmica. Obviamente, o prognóstico individual é multifatorial e a densidade microvascular avalia apenas um determinado momento em uma fração do tumor. Estes aspectos funcionais não puderam ser elucidados através das alterações morfológicas analisadas.

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1 Doutor, Médico Assistente Hospital Heliópolis.
2 Doutor, Professor Centro Universitário Positivo.
3 Mestre, Médica patologista Hospital Heliópolis.
4 Professor livre-docente, Chefe da Disciplina de Cirurgia de Cabeça e Pescoço Escola Paulista de Medicina.
Disciplina de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, UNIFESP-EPM Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Heliópolis.
Endereço para correspondência: Rua Pintassilgo 516 ap. 188 Vila Uberabinha 04514-032 São Paulo SP.
Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da RBORL em 6 de janeiro de 2006.
Artigo aceito em 28 de março de 2006.