INTRODUÇÃO

A lâmina própria tem papel fundamental na viscosidade, contratilidade e formação de onda mucosa da prega vocal. Seu bom funcionamento é determinante para o início e manutenção da vibração sustentada pelo fenômeno de Bernoulli1.

A matriz extracelular da camada superficial da lâmina própria é composta por fibras protéicas e por proteínas intersticiais2. Em humanos, as fibras protéicas distribuem-se paralelamente à borda livre. Dentre elas, as fibras colágenas são as responsáveis pela manutenção da arquitetura local, regulação osmótica e viscosidade3. As fibras colágenas tipo I são maiores, melhor visualizadas e mais rígidas; Já as do tipo III são mais finas, flexíveis e detectadas nos processos cicatriciais iniciais4.

Entre as causas orgânicas de fechamento glótico incompleto, os sulcos vocais e as lesões cicatriciais5 compõem um grupo de afecções que necessita de abordagem especial6,7. Nelas, a composição da lâmina própria sofre alterações patológicas, cuja solução ainda não é totalmente dominada pelos otorrinolaringologistas.

Técnicas cirúrgicas utilizando implantes tais como os de gordura8,9, de fáscia temporalis intacta ou solubilizada10, de colágeno autólogo11,12 e de ácido hialurônico foram tentados, porém os resultados obtidos até o presente momento não foram universalmente aceitos. Pontes et al.13 conseguiram sucesso na recomposição da área subepitelial através da técnica do franjeamento de mucosa, a qual não necessita do uso de enxertos ou implantes.

Gray et al., em 2003, vislumbram uma nova era na Laringologia ao desenvolverem estudos com células pluripotentes para recomposição da matriz extracelular, entretanto, trata-se de uma opção ainda em desenvolvimento e com custos elevados14,15.

Grellet16 propõe uma nova técnica cirúrgica para abordagem dos sulcos vocais. Ela consiste na rotação de um retalho pediculado de mucosa da superfície superior da prega vocal, posicionando-o sob a superfície cruenta da região subepitelial descolada junto à borda livre. Trata-se de uma técnica alternativa que tenta melhorar o fechamento glótico e a reconstituição da onda mucosa.

OBJETIVO

Descrever os achados histológicos ocorridos na camada superficial da lâmina própria de cães ao se aplicar o retalho pediculado de mucosa de prega vocal nos 10º, 30º, 90º, 180º e 360º dias após a intervenção cirúrgica. Verificar as alterações cronológicas ocorridas em cada período de observação dos grupos testes em comparação ao grupo controle, analisando-se os níveis dos seguintes elementos: colágeno total, tipo I, tipo III e núcleos celulares.

material e método

Realizado estudo experimental em cães, o qual foi avaliado e aprovado pelo Conselho de Ética para Utilização de Animais do Campus da USP - Ribeirão Preto (Protocolo 03.1.324.53.6).

Foram selecionados quinze cães adultos, com peso variando entre 12 e 17 kg, saudáveis, não apresentando lesões laríngeas à inspeção ao microscópio cirúrgico e à laringoscopia de contato (Hamou I, Karl Storz 26156B). Todos foram oriundos do biotério da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP. As intervenções cirúrgicas foram realizadas entre os meses de abril de 2002 e maio de 2003. A prega vocal direita foi tomada como teste e a esquerda como controle em todos os cães.

Os cães estudados foram submetidos à anestesia geral venosa, intubação orotraqueal e ventilação por pressão assistida. A indução anestésica foi realizada com 50mg/kg de quetamina, associada a 1ml de xilazina. Após intubação, a anestesia foi mantida com tiopental sódico 40mg/kg. A ventilação por pressão foi ditada pelo aparelho Takaoka (K. TAKAOKA, modelo 850-10) com ciclos de 15 segundos. Foi realizada profilaxia antibiótica com Kefazol, 30 a 40mg/kg.

Para intervenção cirúrgica foram necessários: micro bisturis reto e em ângulo de 90º, micro tesoura, microdescoladores curvo e reto e aspiradores (Karl Storz, Tuttlingen, 1999). O microscópio utilizado foi o M-900 (DF Vasconcellos, São Paulo) com lente de 400mm, MC-A400. A técnica consistiu na confecção de um retalho pediculado de mucosa de prega vocal com irrigação anterior (2cm x 0,2cm) e posicionamento do mesmo em camada superficial de lâmina própria, na região da borda livre (Figuras 1, 2 e 3).

Ao final da cirurgia houve o posicionamento de: 1) Superfície superior de mucosa de retalho pediculado em contato com superfície inferior e cruenta de região subepitelial, junto à borda livre e 2) Superfície inferior de retalho pediculado em contato com superfície cruenta do leito descolado em lâmina própria.

Nas primeiras 72 horas de pós-operatórios, foi prescrita dieta líquida na tentativa de auxiliar o repouso vocal e cicatrização. Os cães foram sacrificados em períodos de 10, 30, 90, 180 e 360 dias após a cirurgia, com o intuito de avaliar o comportamento do retalho pediculado e o processo cicatricial da camada superficial da lâmina própria a curtos e longos prazos. Foi utilizada superdosagem de tiopental sódico intravenoso, seguida de 10 ml de cloreto de potássio a 19,1% para o sacrifício. A obtenção das pregas vocais foi realizada através de uma incisão cervical longitudinal mediana e exposição da laringe por laringofissura.

As pregas vocais foram imersas em parafina no sentido de seu maior eixo e, em seguida, cortes transversais foram realizados entre terços anterior e médio de sua extensão. O corante Syrius Red17 foi utilizado para a análise dos colágenos total, tipo I e tipo III, sob luz polarizada. A Hematoxilina e Eosina visaram a identificação dos núcleos celulares.

As lâminas foram analisadas através do microscópio óptico Olympus BX50 (Olympus Corporation, Ishikawa, Japan), sendo as imagens digitalizadas através da câmera Nikon DXM 1200 (Nikon, Melville, New York) e transferidas para o computador Pentium IV, utilizando-se o aplicativo Image Pro-Plus versão 4.5.1.22 para Windows Media Cybernetics.

Após a preparação histológica obtiveram-se lâminas coradas por Syrius Red e H.E. de 3 pregas vocais testes em 5 períodos diferentes de pós-operatório, além de 15 pregas vocais controle. Os valores das áreas de colágeno total, tipo e tipo III e do número de núcleos celulares de cada grupo teste de três cães correspondente ao 10º, 30º, 90º, 180º e 360º dias de pós-operatório foram analisados de forma descritiva e analítica. As medidas de média e desvio padrão foram usadas para a descrição da amostra. Para comparação de grupos teste e grupo controle utilizou-se o teste U de Wilcoxon-Mann-Whitney para a análise de pequenas amostras, estabelecendo-se um a= 0,05 como parâmetro de rejeição da hipótese de nulidade.

RESULTADOS

Nas lâminas correspondentes ao décimo dia de pós-operatório do grupo teste, o retalho pediculado pôde ser identificado na área correspondente à região superficial da lâmina própria. Após este período apenas a área de seu pedículo pôde ser identificada no 30º dia (3/3), no 90º dia (2/3), no 180º dia (2/3) e no 360º dia (2/3).

A área de colágeno total medida nas quinze pregas vocais dos grupos teste variou entre 688,58m2 e 4097,22m2; desvio padrão de 1155,31 e mediana 1715,62 m2; no grupo controle a área variou entre 1002,21m2 e 3395,33m2, com desvio padrão de 734,33 e mediana 2054,87m2. A área de colágeno tipo III nas quinze pregas vocais dos grupos teste variou entre 58,05m2 e 1479,38 m2, desvio padrão de 241,98 e mediana 261,62m2; a área do grupo controle variou entre 58,27m2 e 1028,38m2, desvio padrão de 248,48 e mediana 475,94m2.

A área de colágeno tipo I dos grupos teste ficou entre 595,17m2 e 3958,30m2, desvio padrão foi 1229,64 e mediana 1113,28m2; a área do grupo controle variou entre 286,23m2 e 2695,80m2, o desvio padrão foi 1229,64 e mediana 1491,46m2.

O número de núcleos celulares nos grupos teste variou entre 21 e 79 núcleos, desvio padrão de 17,51 e mediana 39. No grupo controle a variação de núcleos foi de 8 a 89, desvio padrão foi 23,88 e mediana 27.

A variação da média do colágeno total e tipo I durante o período de observação sugere uma tendência de aumento nos grupos teste dos 90º e o 180º dias de pós-operatório, seguida de queda no 360º dia (Gráfico 1, Tabela 1 e 2). No 30º dia de pós-operatório, as médias do colágeno total e tipo I no grupo teste foram inferiores em relação ao controle (Tabela 1 e 2). Contudo, dos subgrupos (n=3) analisados quanto à área de colágeno total e tipo I, apenas aqueles relativos ao 180º DPO apresentaram diferença estatisticamente significante (p<0,05) em relação ao grupo controle (n=15), aplicando-se o teste U de Wilcoxon-Mann-Whitney.

As médias da área de colágeno tipo III nos grupos teste foram sempre inferiores aos outros grupos de colágeno (Gráfico 1) e alcançaram níveis sempre inferiores aos do grupo controle (Tabela 1 e 2) durante todo o período de observação. Dos períodos de pós-operatório, somente o do 180º dia apresentou níveis reduzidos significativamente (p<0,05).

Não houve correlação estatística nos diferentes períodos de observação pós-operatória quanto ao número de núcleos na camada superficial de lâmina própria entre grupos teste e controle. Houve apenas um aumento inicial da média do número de núcleos no grupo teste no 10º dia de pós-operatório, seguido de queda após este período (Tabela 1 e2).



DISCUSSÃO

Autores como Duke e Shaw consideram que ainda não há uma substância implantável ideal para a aplicação em lâmina própria de pregas vocais18,19. Em estudos conduzidos por Mikus et al.20, constatou-se que houve uma absorção bastante heterogênea de gordura, havendo variação entre 2,3% e 70%, além de piora da qualidade vocal nos 3 a 6 meses de pós-operatório. Duke et al.18 sugeriram viabilidade do enxerto de fáscia até um ano. Entretanto, o resultado pós-operatório pode ser influenciado por extrusão ou absorção precoce. Courey12 sugeriu que a implantação de colágeno na camada superficial de lâmina própria tem potenciais efeitos quanto à redução local da viscosidade.

O retalho desenvolvido na presente técnica seguiu o delineamento vascular paralelo à borda livre. Análises realizadas por Bardach21 estabeleceram que para a viabilidade de um retalho de pele é necessário o fluxo de cerca de 1 a 2ml por minuto para 100cc de tecido. O retalho proposto no presente estudo precisaria de 0,004ml/minuto. Entretanto, esta medida não foi mensurada.

A observação da distribuição cronológica do colágeno total e do tipo I no grupo teste sugeriu um aumento de seus níveis no 90º e o 180º dias de pós-operatório, porém só houve significância estatística no 180º DPO. Rosseau e Thibeault22,23 estudaram o processo cicatricial da lâmina própria e verificaram que o procolágeno era mais presente no 2º mês de pós-operatório, com estabilização de seus níveis no 6º mês, mesmo período em que surgiam, na ferida cirúrgica, colágenos de maior densidade.



Após o 180º dia pós-operatório houve diminuição da média do colágeno total e tipo I, com níveis semelhantes ao do grupo controle. Poucos trabalhos experimentais em laringe estenderam-se por mais que 6 meses, sendo necessários mais estudos para obtenção de melhores conclusões para este último período de observação.

A comparação das médias obtidas pelo grupo no qual foi aplicado o retalho pediculado com os dois grupos teste do trabalho de Cervantes et al.24 é sugestiva de que o presente estudo apresentou níveis inferiores de colágeno total no 30º dia de pós-operatório. Este dado pode ser compatível com menor presença de fibrose local, contudo, devido ao reduzido número de cães teste do atual estudo (n=3) nada pode ser afirmado até o presente momento.

A média da área do colágeno tipo III no grupo teste manteve-se sempre abaixo do grupo controle, contudo só houve diferença estatisticamente significante no 180º dia de pós-operatório.

Os achados relativos à análise do colágeno tipo III diferem parcialmente de outros trabalhos22,23 que notaram que o procolágeno (forma imatura do colágeno) mantinha-se em níveis mais elevados que os mensurados no grupo controle até o 2º mês, além de que no 6º mês havia um simultâneo decréscimo do procolágeno e ascensão do colágeno mais denso.

A análise do comportamento da matriz extracelular após a aplicação da técnica cirúrgica do retalho pediculado revelou que houve alterações significantes quanto ao aumento da área de colágeno mais denso (tipo I), associada à diminuição da área de colágeno imaturo ou menos denso (tipo III) no 180º dia de pós-operatório. Isto pode sugerir semelhanças com os achados pós-operatórios de outros estudos experimentais em laringe, exceto os persistentes baixos níveis do colágeno tipo III durante todo o período de observação.

Estudos mais amplos que contemplem um grupo controle em que tenha sido realizada uma simples incisão e a utilização de anticorpos específicos para identificação dos diferentes subtipos de fibras colágenas, fibras elásticas, fibronectina, ácido hialurônico, outras glicosaminoglicanas, proteoglicanas, lipídios e carboidratos são necessários para o melhor esclarecimento do impacto do retalho pediculado sobre a camada superficial da lâmina própria.

As médias do número de núcleos nos grupos teste alcançaram níveis altos no décimo dia de pós-operatório, evoluindo com decréscimo após o trigésimo dia. Pode-se tratar de um dado compatível com o processo cicatricial na transição da fase proliferativa para a fase de remodelação25, contudo não foram achados resultados estatisticamente significantes em quaisquer períodos observados.

Observações realizadas com laringoscópio de contato no pós-operatório não detectaram surgimento de lesões compatíveis com cistos vocais, bem como alterações significativas na vascularidade do local onde o retalho foi posicionado. Vale a pena ressaltar que o presente estudo foi realizado em cães e a lâmina própria deles possui uma maior quantidade percentual de colágeno que a humana, principalmente na camada superficial17. A análise de colágeno, portanto, pode ser mais acurada para a regeneração no cão do que no homem.

O presente estudo foi inédito quanto ao tempo prolongado de observação pós-operatória em cães (10 dias a 1 ano) e quanto à introdução de uma nova técnica cirúrgica. Algumas questões não puderam ser totalmente respondidas com os resultados obtidos, porém suscitaram novas perspectivas de pesquisas para checar respostas mais completas e complexas.

CONCLUSÕES

O estudo mostrou que no grupo de cães no qual foi realizada a técnica do retalho pediculado de prega vocal houve uma tendência de aumento dos níveis de colágeno total e tipo I na camada superficial da lâmina própria no 90º e 180º dias de pós-operatório, seguido de queda no 360º dia, entretanto, só foi encontrada significância estatística no 180º dia de pós-operatório.

A média de colágeno tipo III do grupo teste foi inferior ao do grupo controle em todos os períodos de observação, contudo, só houve diferença estatística no 180º dia de pós-operatório.

O número de núcleos celulares no grupo teste foi maior no 10º dia de pós-operatório, cursando com diminuição dos seus níveis após o 30º dia, porém não foram achados resultados estatisticamente significantes em quaisquer períodos observados.

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