IntroduçãoVários autores tem estudada a mucosa olfativa do homem e de animais experimentais. Temos entre eles: Von Brunn (1892), Kolmer (1927), Gros Clark (1946)/(1951), Engstrom (1953), Muller (1955), Negus (1958), Von Scherpenberg (1950), Fortunato e Niccolini (1958), Seifert (1970), Naessen (1970), Willemot (1971). Estes trabalhos tem sido realizados sob microscopia óptica ou eletrônica. Os experimentos sob microscopia óptica, na grande maioria tem sido realizados com métodos convencionais de identificação do epitélio olfativo, cuja técnica apresenta alguns inconvenientes, Entre as fases de preparação dos espécimens temos: descalcificação, fixação de secções seriadas do tecido com a posterior reconstrução das secções, completando a técnica. Os tempos decorrentes nas diferentes fases tornam tais métodos muito prolongados.
Devido justamente as dificuldades e imperfeições de tais métodos, eles tem sido relativamente negligenciados. Atualmente as pesquisas sobre epitélio olfativo vem se desenvolvendo com relação ao estudo da ultra-estrutura do tecido.
Deste modo devido as tendências atuais neste campo de se utilizar a microscopia eletrônica, e o relativo abandono dos métodos convencionais com microscopia óptica, o estudo da região olfativa como um todo, e o arranjo especial de sua estrutura celular praticamente não vem sendo realizados.
Por outro lado, este tipo de estudo vem sendo feito com relação ao órgão de Corti e a técnica utilizada é a "técnica de preparações de superfície". Este método permite o estudo de grande número de células de uma só vez e as relações entre elas. Esta técnica que foi metodizada e divulgada por Ergstrom, Ades e Hawkins (1963).
No Brasil vem sendo utilizada, com modificações por Oliveira e Marseillan (1971).
Recentemente em 1971; Naessen realizou um experimento estudando a mucosa na
sal humana e de animais; como a cobaia, utilizando vários métodos histológicos, entre eles ode preparações de superfície do epitélio olfativo normal do animal, obtendo espécimens para estudo ao microscópio de contraste de fases.
No presente trabalho utilizamos a técnica que estamos usando desde 1968 para estudo do órgão de Corti, para estudo do epitélio, olfativo.
Material e MétodosO presente trabalho foi realizado utilizando-se 10 cobaias albinas e não albinas de 300 a 500 grs.
A técnica utilizada pode ser descrita em 3 fases.
1 - Preparação da peça (fixação do complexo etmo-turbinal).
2 - Montagem das preparações de superfície do epitélio olfativo.
3 - Estudo das preparações.
1 - Preparação da peça:
1º tempo - Decapitação da cobaia e fixação preliminar:
Após a realização da tricotomia cefálica e cervical, corta-se a cabeça do animal com instrumento cortante forte e em seguida colocando-se cânulas de polietileno nas fossas nasais, injeta-se o fixador em direção ao complexo etmo-turbinal (fig. 1).
FIG. 1 - Cânula de polietileno introduzida pela narina esquerda da cobaia em contato com o complexo etmo-turbinal para administração do fixador.
2º tempo - Acesso ao complexo etmo-turbinal:
Após a decapitação a cabeça é lavada e com tesoura retiram-se as partes mofes do crânio (pele, subcutâneo e músculos). Em seguida, com ruginas retira-se o periósteo da parte superior da calota craniana.
Com uma serra circular delicada montada em motor, abre-se a parede óssea superior das fossas nasais, expondo-se deste modo, os 2 complexos etmo-turbinais, nas paredes laterais das fossas nasais ao lado do septo nasal (fig. 2).
FIG. 2 - Estrutura etmo-turbinal da fossa nasal esquerda, observando-se as 4 divisões.
3º tempo - Fixação definitiva do complexo etmo-turbinal
Uma vez expostas as duas fossas nasais, injeta-se o fixador sobre a mucosa nasal do complexo etmo-turbinal e em seguida a peça assim preparada é deixada num frasco etiquetado, cheio de fixador, durante tempos variáveis, até as preparações de superfície serem montadas.
As manobras deste tempo e as do anterior, são feitas ao estereomicroscópio cirúrgico (Otoscópio Zeiss).
2 - A montagem das preparações de superfície:
1º tempo - Localização e dissecção do epitélio olfativo na mucosa nasal:
Após a localização do epitélio olfativo no: complexo etmo-turbinal, com estiletes delicados retiram-se fragmentos retangulares do epitélio.
2º tempo - Montagem da preparação:
Os fragmentos retirados descolados da parede óssea do complexo etmo-turbinal, são montados entre lâminas e lamínulas em glicerina.
3 - O estudo da preparação:
A preparação de superfície é então examinada ao microscópio de contraste de fases Standard RA Zeiss e são tiradas fotos para documentação.
Podemos examinar a preparação no plano mais superficial onde se encontram os botões olfativos com os cílios e no plano logo abaixo onde vemos as células de sustentação do epitélio olfativo (figs. 3 e 4).
FIG. 3 - Fotomicrografia de contraste de fase, mostrando plano do tecido de sustentação do epitélio olfativo. Aumento 560x.
FIG. 4 - Fotomicrografia de contraste de fase mostrando o plano dos botões olfativos. Observam-se os cílios olfativos. Aumento 1400x.
O trabalho de Naessen em 1970, permitindo a localização da mucosa olfativa na cobaia, inclusive mostrando o limite entre esta mucosa e a mucosa respiratória, facilitou a identificação do epitélio olfativo para a aplicação da técnica utilizada neste trabalho.
Pode-se observar que a técnica de preparações de superfície permite a localização exata das áreas estudadas, dá informações sobre o estado e localização de todas células sensoriais ou de um grande grupo representativo delas; é simples e reprodutível em laboratório, consome muito pouco tempo as suas diferentes fases, as observações são mais fáceis de Interpretar do que aquelas feitas com secções tangenciais do tecido incluído.
Neassen (1971), utilizou como fixador o ácido ósmio. Neste trabalho como nos outros com órgão de Corti, utilizou-se a formalina 10% em tampão fosfato 0,1M pH7 (Oliveira e Marseillan, 1968), Com o emprego deste fixador tem-se obtido resultados similares aos anteriores, sendo de preparação e conservação muito mais simples.
Pôde-se observar que a zona que permite o estudo da preparação de superfície ao microscópio de contraste de fase é a zona periférica não nucleada.
Esta zona consiste das partes distais das células suportes e das extensões periféricas dos corpos celulares das células sensoriais. Esta zona é coberta por uma camada sero-mucinosa. Esta parte do epitélio é relativamente transparente e pode ser estudada com o microscópio de contraste de fases, ao contrário da zona inferior nucleada para qual o método não é bom.
Pode-se observar com a técnica e conforme mostram as figuras a cito-arquitetura do epitélio de sustentação num plano óptico mais inferior, e os botões olfativos com cílios formando a imagem solar, num plano mais superficial.
ResumoEste trabalho apresenta detalhes da técnica de "preparação de superfície" para identificação e estudo cito-arquitetural do epitélio olfatório da cobaia. O método consiste na microdissecção dos ossos nasais no animal decapitado para exposição e fixação dos complexos etmo-turbinais. O fixador usado é o formaldeido 10% em tampão fosfato 0,1M. Imediatamente após fixação, segmentos da mucosa olfativa são separados do osso, montados com glicerina entre lâmina e lamínula e fotografados com um microscópio de contraste de fase. Com esta técnica é possível estudar a localização e estado de grandes grupos representativos de células sensoriais de uma só vez. Também o procedimento é simples e os resultados são fáceis de interpretar. Os planos superficiais da mucosa são os mais apropriados para este tipo de estudo, mostrando as porções distais das células suportes e as extensões periféricas dos corpos celulares das céulas sensoriais.
SummaryThis report presents details of the "surface preparation" technique for identification and cytoarchitectural study of the olfactory epithelium of the guinea pig. The method consists in the microdissection of the nasal bones in the decapited animal to expose and fixate ethmo-turbinal complexos. The fixative utilized is 10% formaldehyde in 0,1M phosphate buffer. Immediately after fixation, segments of the olfactory mucosa are separated from the bone and mounted with glycerin on microscopy slides, and photographed with a phase-contrast microscope. With this technique it is possible to study the localization and condition of large numbers of sensory cells in each field. Also, the procedure is simple and the results easy to interpret. The superficial layers of the mucosa are the most appropriate for this type of study, showing the distai portions of the support cells and the peripheral extensions of the sensory cell bodies.
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14. Willemont, J., Wielemans, R., Mac Leod, P., Persin, C. - Volfaction. Acta Oto-RhinoLaryngologica Belgica, 1971, 25: pp. 542.
* Professor Assistente Doutor contratado do Departamento de Oftalmologia e Otorrino-laringologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Professor Assistente Doutor de Anatomia e Fisiologia Humana da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto.
** Professor Livre Docente do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
