O exame microscopico de qualquer material suspeito suma importancia para o diagnostico precoce da difteria. Bem sabemos o auxilio que o exame rigorosamente praticado trazer ao clinico diante de um desses casos, às vezes grave, quer pela molestia em si quer pela sua localização. Sabemos, tambem, que quanto mais cedo se aplica o sôro especifico, tanto melhor é o resultado no que diz respeito à cura do doente e menor duração da molestia. Assim sendo, estamos em condições de afiançar que o exame bacterioscopico do material suspeito, geralmente constante de exsudatos, pode ser fornecido dentro de 15 a 20 minutos e o exame das culturas em meios especiais, a começar pelo de Loeffler, pôde ser obtido a partir de 6 horas após a semeadura e permanencia na estufa a 37°.
A colheita do material necessita cuidado pois que devemos fazê-la nos pontos em que a lesão se mostre mais típica. Nos casos em que existe a falsa membrana, a operação torna-se simples Para a obtenção desse material usa-se um bastão metálico com algodão na ponta, e esterilizado no interior de tubo de ensaio fechado com rolha de algodão. Abre-se sómente no mo mento de usar.
Logo que se recebe o material é o mesmo passado nos meios de cultura, fazendo-se, logo a seguir, os esfregaços que são fixados pelo calor e submetidos às colorações indicadas. São estas o método de Gram e um ou mais métodos destinados a corar as granulações metacromáticas. Ambos os processos se aplicam tanto aos esfregaços das secreções como aos das culturas.
O método de Gram é praticado segundo a técnica corrente. O bacilo diftérico é Gram positivo e tem a particularidade de apresentar-se em aglomerados; conforme se vê nas figuras 1 e 2.
Microfotografia de esfregaço de secreção mucosa contendo bacilos com caracteres tipicos de diftéricos. Coloração pelo método de Gram.
Microfotografia de esfregaço de cultura de material suspeito de diftérico. Vêm-se os bacilos aglomerados e com os caracteres dos de Klebs-Loeffler. Coloração pelo método de Gram.
Microfotografia de esfregaço de cultura antiga de bacilo diftérico. Coloração pelo método de Gram.
Microfotograia de esfregaço de cultura de bacilo diftérico. Coloração pelo método do azul de mentileno-lugol, segundo simplificação do autor.
Microfotografia de esfregaço de cuçtura de Corynebacterium pseudodiphtericum. Coloração pelo método do azul de mentileno-lugol, segundo simplificação do autor.
Microfotografia de esfregaço de cultura de Corynebacterium hodgkinii. Coloração pelo método do azul de mentileno-lugol, segundo simplificação do autor.
Alem disso, apresenta fórmas irregulares, de maneira um pouco diversa da observada para a maioria dos bacilos. São fórmas em clava, haste de tambor, etc. Estas fórmas, no entanto, são mais comuns nas culturas antigas (Fig. 3) Constituem caracteres morfologicos tipicos.
Uma vez observados os bacilos com os caracteres acima descritos, passamos a aplicar, em outros esfregaços, um dos métodos, ou mais, para corar granulações metacromáticas. Constituem estas um dos elementos de maior valor no diagnostico do germen. São inumeros os métodos destinados a esse fim. Ha alguns anos vimos empregando a simplificação que adotamos com os melhores resultados. Consiste em corar os esfregaços fixados pelo calor com solução de Azul de metileno:
Azul de metileno - 1,0 grm.
Alcool - 10,0 grms.
Acido fenico - 1,0 grms.
Agua destilada -100,0 cc.
Deixar agir durante 1/2 minuto, lavar em agua e tratar pela solução de Lugol:
lodo metaloidico - 1,0 grm.
lodeto de potassio - 2,0 grms.
Agua destilada - 100,0 cc.
Deixar agir durante 1/2 minuto, lavar em agua, secar e examinar com lente de imersão homogenea.
Os tempos de atuação do corante e da solução de Lugol pódem ser alterados sem que se prejudique a coloração. Sómente o azul de metileno não deve ser alcalino.
Por este processo, as granulações aparecem escuras, quasi negras e o corpo bacilar em pardo claro com as faixas que se notam no interior da célula, um pouco mais escuras (Fig. 4). Conforme dissemos, este método tem-se mostrado excelente, tanto para o exame do material dos exsudatos como para o das culturas.
Insistimos em aconselhá-lo em vista de ser extremamente simples de executar-se e com a vantagem de encontrar-se em qualquer laboratorio os corantes e soluções que nele se usam.
A natureza das granulações evidenciáveis por esse método ou outros permanece obscura quer quanto à sua constituição quimica quer quanto ao seu significado fisiologico. Têm sido encaradas como material de reserva, de secreção ou excreção e mesmo, o que não foi provado, como elemento formador da toxina ou até a propria toxina. Inicialmente, foram interpretadas como espóros devido à imperfeição dos processos de pesquisa. O que apresentam de mais curioso é o modo de tomar determinados corantes, apresentando a metacromasia. Infelizmente, estes caracteres não são exclusivos do bacilo diftérico, mas se notam tambem em outras especies consideradas não patogenicas e pertencentes, como aquele bacilo, ao genero Corynebacterium (Figs. 5 e 6). Nestes casos as granulações costumam apresentar-se em numero mais reduzido assim como são mais irregulares.
Pelos exames que temos praticado em material suspeito de diftéria, em numero regularmente elevado, concluimos pela grande segurança do exame microscópico diréto quando os bacilos, com os caracteres acima, que são os do diftérico, apresentam-se em abundancia. Ainda não observamos nenhum caso em contrario.
Quando os bacilos existem em numero reduzido, a ponto de impedir a certeza no diagnostico, ou mesmo não são encontrados, é prudente, nos casos suspeitos, prosseguir os exames fazendo culturas em meios especiais e provas de virulencia do germen isolado.
BIBLIOGRAFIABIE, V. - Deut. Aerme-Zeit., p. 385, 1904.
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NEISSER, M. - Zeit. F. Hyg. u. Inf. p. 443, 1897.
(*) Chefe de Laboratorio do Instituto Oswaldo Cruz e Hospital S. Francisco de Assis.
Rio de Janeiro.
